Imagen confocal de alta resolución de hemocitos infectados por Drosophila con patógenos

Resumen

Fuente: Hiroyasu, A., et al. Extracción de hemocitos de larvas de Drosophila melanogaster para infección microbiana y análisis. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demuestra imágenes confocales de alta resolución de hemocitos de Drosophila melanogaster infectados con Coxiella burnetii para visualizar la localización de patógenos en 3D, permitiendo un análisis detallado de la dinámica de la infección intracelular y las interacciones huésped-patógeno.

Protocolo

1. Imagen Confocal
   1. Configura el microscopio confocal para imágenes en tres colores de DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindol), EGFP (proteína fluorescente verde mejorada) y mCherry. Utiliza la siguiente configuración: excitación DAPI (ex) 405 nm, emisión (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
   2. Coloca la muestra en el microscopio y enfoca la muestra usando un objetivo de apertura numérica (NA) de 63X/1.4. Localiza los hemocitos deseados en el campo de visión para la imagen.
   3. Ajusta la potencia láser y las ganancias del detector para lograr una exposición adecuada de la muestra. Revisa varios planos z para asegurarte de que el nivel de exposición es adecuado para todo el grosor de la muestra.
   4. Encuentra las posiciones superior e inferior en el eje z de un hemocito completo. Establece estas posiciones como las posiciones de inicio y final para la sección en z.
   5. Solo usa zoom de escaneo para obtener imágenes del área que contiene el hemocito. A menudo se utilizan factores de zoom de 3X.
   6. Recoge la serie de imágenes a resolución adecuada, como 1024 x 1024 píxeles en el plano x-y y un espaciado de 0,3 μm en la dimensión z.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Coxiella burnetii - mCherry	Dr. Heinzen, R.
Vidrio de cubierta de microscopio	Fisher Scientific	12-545-80
4',6-diamidino-2-fenilindol	Thermo Fisher Scientific	62247
Microsope confocal	Leica	Microscopio láser confocal de luz blanca TCS SP8-X
Portaobjetos de microscopio	Fisher Scientific	12-552-3