Análisis de una sola célula de la expresión génica de patógenos extraídos por plantas

Resumen

Fuente: Rufián, J. S., et al. Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae en el tejido vegetal. J. Vis. Exp. (2022).

Este vídeo demuestra un método para analizar la expresión génica en bacterias patógenas extraídas de plantas a nivel unicelular utilizando un factor de transcripción marcado con fluorescencia. La imagen confocal revela heterogeneidad en la expresión génica de virulencia, destacando la diversidad funcional dentro de una población bacteriana clonal.

Protocolo

1. Análisis unicelular de la bacteria extraída del apoplasto

1. Prepara una solución de agarosa al 1,5% en agua destilada. Una vez derretido, añade suficiente volumen para rellenar el espacio entre dos portaobjetos de microscopía colocados uno al lado del otro y coloca otro portaobjetos encima (Figura 1). Déjalas secar durante 15 minutos y quita cuidadosamente el lavabos colocado en la parte superior. Con una hoja, corta la almohadilla de agarosa en piezas de 5 mm x 5 mm justo antes de usarla.
2. Paralelamente, centrifugar 1 mL de la bacteria extraída del apoplasto a 12.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente, retirar cuidadosamente el sobrenadante usando una pipeta y volver a suspender el pellet en 20 μL de agua para concentrar las células. Coloque una gota de 2 μL de las celdas concentradas sobre un tobogán de 0,17 mm y cubra la gota con un trozo de 5 mm x 5 mm de la almohadilla de agarosa obtenida previamente en el paso 1, como se representa en la Figura 1.
3. Visualiza la preparación bacteriana bajo el microscopio confocal (véase Tabla de Materiales). Para identificar bacterias fluorescentes verdes, se utiliza el láser de excitación a 488 nm y un filtro de emisión que va de 500 nm a 550 nm. Para identificar todas las bacterias, utiliza el campo brillante y fusiona ambos campos.
4. Procesa las imágenes confocales usando Fiji (véase Tabla de Materiales). Para ello, utiliza el plugin MicrobeJ para identificar el contorno de la célula bacteriana y medir la intensidad de fluorescencia en su interior.
   NOTA: Se recomienda la adquisición de imágenes a partir de bacterias aisladas (no agrupadas) para este análisis.

Resultados

Figura 1: Representación esquemática del montaje y preparación de la almohadilla de ágar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cubierta de 0,17 mm			No hay requisitos especiales
Malla metálica de 1,6 x 1,6 mm	Buzifu		Malla de malla de malla de fibra de vidrio
Tubos cónicos de 50 mL	Sarstedt
Agarose	Merk
Microscopio Confocal Stellaris	Leica Microsystems
Software de Fiyi