Modelo intestinal in vitro para evaluar la adhesión bacteriana e internalización

Resumen

Fuente: Calatayud Arroyo, M., et al. Evaluación de la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz intestino-microbio in vitro. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demuestra un modelo intestino-microbio in vitro para estudiar la viabilidad bacteriana. Se incuba un cocultivo de células Caco-2 y HT29-MTX con bacterias pretratadas bajo condiciones digestivas simuladas. Se evalúa la integridad de la barrera epitelial utilizando resistencia eléctrica transepitelial, y se recogen fracciones del medio, mucosidad solubilizada, lisado celular y restos celulares para análisis posteriores.

Protocolo

1. Cepas y condiciones de cultivo

NOTA: La comunidad oral sintética estaba compuesta por cepas comúnmente presentes en el microbioma oral.

1. Obtenga las siguientes cepas de la Colección Americana de Cultivo Tipo (ATCC): Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Streptococcus gordonii (ATCC 49818), Actinomyces viscosus (ATCC 15987) y Streptococcus mitis (ATCC 49456).
2. Adquirir Veillonella parvula de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares del Instituto Leibniz DSMZ (DSM 2007), Streptococcus sanguinis de la Colección de Bacterias BCCM/LMG (LMG 14657), y utilizar la cepa TOVE-R de Streptococcus salivarius y Streptococcus oralis.

2. Desarrollo de una comunidad multiespecie representativa del microbioma oral

NOTA: Generar una comunidad sintética para simular la posible capacidad de adhesión de las bacterias orales al epitelio intestinal in vitro . Cultivar bacterias en placas de agar sanguíneo suplementadas con 5 μg/mL de hemin, 1 μg/mL de menadiona y 5% de sangre estéril defibrinada de caballo. En resumen:

1. Disuelve 100 mg de hemín en 2 mL de 1 M hidróxido de sodio (NaOH) y añade 100 mL de agua destilada autoclavada. Guárdalo en un recipiente oscuro. Esteriliza con un filtro de 0,22 μm antes de añadirlo al medio.
2. Disuelve 100 mg de menadiona en 20 mL de etanol al 96%. Esteriliza con un filtro de 0,22 μm antes de añadirlo al medio.
3. Prepara 1 L de medio de ágar sanguíneo (véase Tabla de Materiales) según las instrucciones del fabricante y el autoclave. Déjalo enfriar antes de añadir la sangre de caballo y los suplementos. Mezcla y vierte los platos.
4. Prepara caldo modificado de infusión cerebral y cardíaca (BHI). Añade 5 μg/mL de hemín y 1 μg/mL de menadiona tras el autoclav.
5. Dispensar 9 mL del medio en tubos Hungate y cerrar con un tapón de goma y una tapa de aluminio. Enjuaga los tubos con nitrógeno/dióxido de carbono o N₂/CO₂ (90%/10%).
6. Saca 1 mL de medio anaeróbico con una jeringuilla y colócalo en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Elige colonias individuales de cada especie bacteriana, resuspende en el medio y transfiere de nuevo al BHI modificado anaeróbico. Incubar durante 48 horas a 37 °C, excepto S. salivarius, que debe ser incubado durante 24 horas.
7. Si es necesario, confirma la pureza de las culturas antes de formar la comunidad sintética. En resumen:
   1. Extraer ADN de los cultivos líquidos y amplificar el gen 16S rRNA usando los cebadores 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) y 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT), y el siguiente programa: 5 minutos a 95 °C, 30 ciclos de 95 °C durante 1 minuto, 55 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 1,5 minutos, seguido de un paso final de extensión de 5 minutos a 72 °C.
   2. Purificar el producto de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con un kit comercial (véase la Tabla de Materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante.
   3. Realizar la reacción de secuenciación de los productos purificados en un volumen total de 10 μL que contenga 0,5 μL de colorante (véase Tabla de Materiales), 3,2 pmol de cebador M13f (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), 2,0 μL de tampón de secuenciación 5x y 20 ng de plantilla, utilizando un sistema de secuenciación comercial con kit (véase Tabla de Materiales).
      NOTA: Realizamos este procedimiento comercialmente.
   4. Realiza una búsqueda BLAST en todas las secuencias (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para determinar el taxón conocido más cercano y compáralo con la secuencia de la cepa original usando la herramienta en línea RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) y el servicio de alineación SINA (https://www.arb-silva.de/aligner/).
8. Mide el número de células al final de la incubación, usando citometría de flujo y tinción SYBR Green/Propidium Yoduro. Diluye los cultivos a 10⁵ células ^mL-1, usando BHI modificado.
9. Añadir 1 mL de S. mitis a 75 mL de BHI anaeróbico e incubar hasta la fase estacionaria (6 h). A continuación, recoge 0,75 mL de cada cepa diluida y mézclala en condiciones anaeróbicas.
10. Una vez mezcladas todas las culturas, toma 1 mL del microcosmos y súgdelo a los 75 mL de BHI. Incubar la comunidad sintética con un 10% de_CO2, 10% hidrógeno (_H2), 80% N, durante 48 horas a 37 °C y 200 rpm (véase la Tabla de Materiales).
11. Mide la densidad celular como en 2,8. antes de presentar la comunidad al modelo celular. La composición de la comunidad puede evaluarse mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Además, utiliza la secuenciación del amplicon del gen 16S rRNA para proporcionar información sobre los miembros iniciales presentes. Para cualquiera de los protocolos que confirman la identidad, utiliza el ADNc como plantilla para indicar que las bacterias transcriben proteínas activamente, y el ADN como plantilla para revelar la presencia o ausencia de las cepas.

3. Prácticas generales de cultivo celular

NOTA: Obtener líneas celulares utilizadas de la Colección Europea de Cultivos Celulares Autenticados (Caco-2 ECACC 86010202 y HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, Public Health England, Reino Unido). Se pueden comprar reactivos para cultivo celular (véase Tabla de Materiales), salvo que se especifique lo contrario.

1. Mantenimiento y paso de líneas celulares Caco-2 y HT29-MTXNOTA: Las células Caco-2 y HT29-MTX se cultivan rutinariamente en matrazos de cultivo^{tisular de 25 cm 2} que contienen el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado (Tabla 1). Las células se tripsinizan cuando se alcanza una confluencia del 60–70%.
   1. Retira el medio de cultivo celular de los frascos. Lava dos veces con 5 mL de PBS sin calcio/magnesio (Ca⁺⁺/Mg⁺⁺).
   2. Añade 2 mL de una solución de tripsina de 0,5 mg/L y 0,22 g/L de ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA). Distribuye la solución de tripsina moviendo suavemente el matraz. Retira 1,5 mL de la solución de tripsina e incuba el matraz a 37 °C durante 10 minutos.
   3. Comprueba bajo el microscopio si las células están separadas de la superficie del matraz. Incuba durante 5 minutos más, si es necesario.
   4. Añade 5 mL de medio de cultivo celular suplementado al matraz para inactivar la tripsina. Pipetear arriba y abajo para obtener una suspensión homogénea de célula única.
   5. Inmediatamente, toma una alicuota de 50 μL de la suspensión celular y mézclala con una solución estéril de azul de Tripán al 0,4% en proporción 1:1 (v/v) para las células Caco-2 o 1:5 v/v para HT29-MTX. Se mezcla pipeteando y carga en una cámara de conteo (véase la Tabla de Materiales).
   6. Cuenta las células viables (glóbulos blancos brillantes) bajo el microscopio (véase las instrucciones del fabricante).
   7. Semilla en un nuevo matraz con una densidad de 4 x 10⁵ células/^{cm 2} y 1 x 10⁴ celdas/^{cm 2}, para Caco-2 y HT29-MTX, respectivamente.
      NOTA: (1) Las células Caco-2 se diferencian y forman uniones estrechas una vez alcanzadas la confluencia. Es extremadamente importante evitar la sobreconfluencia antes de la tripsinización. El crecimiento excesivo de células en el matraz puede causar fallo en el desprendimiento celular tras la tripsinización y/o la agrupación celular. (2) Las células HT29-MTX son células productoras de moco con alta actividad metabólica. Estas características pueden provocar una rápida acidificación del medio de cultivo celular, especialmente si las células están en alta densidad. El tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanolsulfónico (HEPES) puede añadirse al medio de cultivo celular (Tabla 1) para mantener el pH entre 7 y 7,2. Si el pH baja, el medio puede cambiarse cuando la confluencia es inferior al 50%. Sin embargo, si la confluencia >50%, el cultivo celular debe dividirse.

4. Montaje de un modelo de celda multicompartimento que simula la interfaz anfitrión-microbio intestinal

NOTA: Completar el cocultivo en pozos de doble cámara (diámetro 24 mm, tamaño de poro 0,4 μm; véase Tabla de Materiales).

1. Añade 1,5 mL de medio de cultivo celular completo al compartimento apical y 2 mL al basal. Preincubar durante 20–30 minutos para obtener una distribución uniforme de la suspensión celular durante la siembra.
2. Tripsinizar el cultivo celular de Caco-2 y HT29-MTX como se describe en la sección 3. El procedimiento de tripsinización debe seguirse con precisión para lograr una distribución homogénea de ambas líneas celulares, en una sola suspensión celular, sin grumos.
3. Cuenta las células viables como se describe en la 3.1.8.
4. Ajusta la densidad celular a 6,5 x 10⁴ células/cm² en una proporción 90/10 de celdas Caco-2/HT29-MTX.
5. Homogeneizar las suspensiones celulares y añadir el volumen correspondiente de células Caco-2 y HT29-MTX a un recipiente estéril prellenado con medios de cultivo celular suplementados. Retirar el medio preincubado del lado apical de la cámara por aspiración.
6. Mezclar suavemente la suspensión de la celda pipeteando y transferir 1,5 mL al compartimento apical de los insertos de la cámara. El procedimiento de siembra requiere una homogeneización constante de la suspensión celular, ya que las células tienden a sedimentar. Dependiendo de la experiencia del usuario y la velocidad de trabajo, la suspensión de las celdas debe mezclarse tras dispensar entre 1 y 3 pozos.
7. Mueve las placas suavemente hacia adelante y hacia atrás y luego de derecha a izquierda a derecha (5–10 veces) para obtener una distribución uniforme de las células en el pozo. Transfiere a la incubadora y repite el movimiento de las placas.
8. Mantener el cocultivo de células Caco-2/HT29-MTX durante 15 días, renovando los compartimentos apical y basal cada 2 días con DMEM suplementado. Tras este tiempo, el medio de cultivo celular puede cambiarse a DMEM suplementado sin necesidad de solución antibiótica o antimicótica.
9. Mantén el sistema hasta 20–21 días después de la siembra, renovando el medio cada 2 días.
10. Mide la integridad de la barrera epitelial antes de comenzar el ensayo, utilizando un Sistema de Resistencia Eléctrica (véase Tabla de Materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante.
    1. Asegúrese de que el equipo de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) esté completamente cargado (>24 h) antes de comenzar las mediciones.
    2. Desconecta el equipo TEER de la fuente de alimentación y cúbrelo con una bolsa de autoclave de plástico. Haz un agujero en la bolsa para introducir el electrodo y conectarlo al puerto de entrada del medidor. Rocía con etanol/agua (v/v) al 70% antes de introducir el equipo TEER en el armario de flujo.
    3. Para desinfectar el electrodo, sumerge las puntas del electrodo en una solución al 70% de etanol/agua (v/v) durante 15 minutos. Deja secar al aire durante 15 segundos. Enjuaga el electrodo en medios de cultivo celular previamente calentados.
    4. Saca las celdas de la incubadora y deja que las células alcancen la temperatura ambiente dentro del armario de flujo.
    5. Asegúrate de que el contador esté desconectado del cargador. Pon el interruptor de modo en Ohms y enciende el interruptor de encendido.
    6. Mide la resistencia de la celda sumergiendo el electrodo con la punta más corta en el inserto y la punta más larga fuera del pozo. Mantén el electrodo en un ángulo de 90° respecto al inserto de la placa.

5. Supervivencia bacteriana tras condiciones de tránsito gastrointestinal in vitro

NOTA: Prepara todas las diluciones con agua ultrapura. Filtrar todas las soluciones mediante un filtro de 0,22 μm y realizar el procedimiento de digestión en condiciones estériles.

1. Digestión oral:
   1. Colocar 3 mL de la comunidad bacteriana en un tubo estéril de 50 mL, mezclar con 3 mL de fluido salival simulado (SSF), que contiene (en mmol ^L-1): cloruro de potasio (KCl), 15,1; fosfato de dihidrógeno potásico (KH₂PO₄), 3,7; bicarbonato sódico (_{NaHCO 3}), 6,8; cloruro de magnesio hexahidrato [MgCl₂(_{H 2}O)₆], 0,5, carbonato de amonio [(NH₄) CO₃], 0,06; ácido clorhídrico (HCl), 1.1; cloruro de calcio dihidratado [CaCl₂(H₂O)₂], 0,75. Añadir 75 U/mL de α-amilasa de saliva humana tipo IX-A y 2 g/L de mucina del estómago porcino tipo II al SSF.
   2. Incuba la mezcla durante 2 minutos a 37 °C y 100 rpm. Recoger una muestra de 2 mL para extracción de ADN y cuantificación por citometría de flujo (S1).
2. Digestión gástrica:
   1. Añadir 4 mL de líquido gástrico simulado (SGF), que contiene (en mmol L-1): KCl, 6,9; KH₂PO₄, 0,9; NaHCO₃, 25; cloruro de sodio (NaCl), 47,2; MgCl₂(_H2O)₆, 0,1; (NH₄)CO₃, 0,5; HCl, 15,6; CaCl₂(H₂O)₂, 0,075. Además, el SGF contenía 2 g/L de mucina del estómago porcino tipo II.
   2. Mide el pH y ajusta a pH 3 con 1 M de HCl, si es necesario. Incubar a 37 °C y 100 rpm. Recoge una muestra de 2 mL (S2).
3. Digestión del intestino delgado:
   1. Añadir 4 mL de líquido intestinal simulado (SIF) que contiene (en mmol L-1): KCl, 6,8; KH₂PO₄, 0,8; NaHCO₃, 85; NaCl, 38,4; MgCl₂(H₂O)₆, 0,33; HCl, 8.4; CaCl₂(H₂O)₂, 0,3, al tubo digestivo.
   2. Ajusta a pH 7 con 1 M de NaOH, si es necesario. Incubar a 37 °C y 100 rpm. Recoge una muestra de 2 mL (S3).

6. Capacidad de colonización bacteriana tras condiciones de tránsito gastrointestinal in vitro

1. Centrifugar 2 mL de digestión del intestino delgado durante 10 minutos a 2.650 x g.
2. Retira el sobrenadante y mezcla el pellet bacteriano con 5 mL de DMEM suplementado sin antibióticos ni antimicóticos.
3. Manchar y cuantificar las células intactas/dañadas usando un citómetro de flujo (véase la Tabla de Materiales).
4. Ajusta la densidad celular a 10^{a 5} células viables/mL diluyendo DMEM suplementado sin antibióticos ni antimicóticos.
5. Retira el medio apical del sistema transwell y añade 1,5 mL de la suspensión bacteriana. Co-cultivo del sistema durante 2 horas bajo condiciones generales de cultivo celular (37 °C, 95% de humedad, 5% de_CO2).
   NOTA: Este tiempo puede extenderse hasta 48 horas, dependiendo del protocolo experimental requerido. El cocultivo puede mantenerse en una incubadora diferente a la utilizada para el mantenimiento celular rutinario, para evitar contaminaciones.
6. Mide los valores TEER tras la incubación para evaluar la integridad de la barrera epitelial como se describe en la 4.11.
7. Al completar el tiempo de incubación, retirar el medio apical y recoger 0,5 mL para análisis posteriores (S4). Una submuestra de medio puede utilizarse para evaluar la viabilidad celular mediante un ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH) (véase la Tabla de Materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante.
8. Añadir 0,5 mL de 10 mM de N-acetilcisteína en HBSS (buffer NAC) para solubilizar el moco producido por el HT29-MTX y recuperar las bacterias adheridas. Incubar las placas a 37 °C durante 1 hora, agitando (135 rpm, véase la Tabla de Materiales).
9. Recuperar el NAC-HBSS en un tubo microcentrífuga (S5) y lavar las células dos veces con 1 mL de DPBS.
10. Añade 0,5 mL de 0,5% de Triton X-100 (p/v) encima de las monocapas, altera las células pipeteando, recupera el líquido y haz un vórtice durante 1 minuto. La rapidez es crucial para evitar dañar las células bacterianas con el detergente.
11. Centrifuga las celdas durante 5 minutos a 2.650 x g y separa el sobrenadante (S6) y el pellet (S7).

7. Análisis de muestras

NOTA: Analizar las muestras recogidas (S1-S7) para evaluar la viabilidad bacteriana y el potencial de adhesión a las células intestinales, tras simular una digestión gastrointestinal.

1. Viabilidad bacteriana: Pasar muestras S1-S5 dos veces por un filtro de 0,45 μm y cuantificar las células bacterianas usando tinción de células vivas/muertas y citometría de flujo, como se indica en el paso 2.8.
2. Potencial de adhesión: Preparar diluciones en serie (-1 a -8) para S1-S6 y hacer una estría: 10 μL en ágar sanguíneo y placas BHI modificadas. Incubar a 37 °C en condiciones anaeróbicas durante 24–48 horas. Placa el mismo volumen de S7 sin diluir.
   1. Identificación taxonómica de bacterias adheridas:
      1. Elige colonias individuales con un lazo de cultivo y vuelve a suspender cada una en 10 μL de agua libre de nucleasa. Recoge 4 μL de esta suspensión y úsala como plantilla para la amplificación por PCR del gen 16S rRNA usando los cebadores y condiciones descritos en 2.7.1.
      2. Realizar secuenciación siguiendo el protocolo en 2.7.3 y validar la secuencia usando el procedimiento incluido en 2.7.4.
3. Realizar análisis posteriores adicionales como extracción total de ADN, cuantificación qPCR y/o secuenciación de amplicones de ARNr 16S, extracción de ARN y perfilado transcriptómico según se desee.
   NOTA: La cuantificación de citometría de flujo se realizó inmediatamente después del muestreo. Como control para células permeabilizadas por membrana, se utilizó una muestra expuesta a 70 °C durante 3 minutos. El ruido de fondo se evaluó midiendo con citometría de flujo los fluidos digestivos o muestras obtenidas del modelo de cultivo celular sin bacterias. Cada muestra se midió en triplicado.

 

Tabla 1: Descripción de las líneas celulares y la composición del medio para el mantenimiento del cultivo celular.

Cultivo celular	Adherente/ Suspensión	Medio de cultivo	Suplementos generales	Suplementos específicos	Duplicar el tiempo	Condiciones de incubación
Caco-2 (ECACC 86010202)	Adherente	Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con 4,5 g/L de glucosa	Suero fetal bovino inactivado (10% v/v) Penicilina (100 U/mL)* Estreptomicina (0,1 mg/mL)* Anfotericina (0,0025 mg/mL)*	Glutamax (4 mM) Aminoácidos no esenciales (1% v/v) Piruvato (1 mM)	65–72 h	95% de humedad y 10% de CO 2 CO2 (véase Tabla de Materiales)
HT29-MTX (ECACC 12040401)	Adherente			HEPES (1 mM)	20–24 h
* Los antibióticos y antifúngicos se retiraron del medio de cultivo celular 2 días antes de comenzar los ensayos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CEPAS
Aggregatibacter actinomycetemcomitans	Colección de Cultura de Tipo Americano	ATCC 43718
Fusobacterium nucleatum	Colección de Cultura de Tipo Americano	ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis	Colección de Cultura de Tipo Americano	ATCC 33277
Prevotella intermedia	Colección de Cultura de Tipo Americano	ATCC 25611
Streptococcus mutans	Colección de Cultura de Tipo Americano	ATCC 25175
Streptococcus sobrinus	Colección de Cultura de Tipo Americano	ATCC 33478
Actinomyces viscosus	Colección de Cultura de Tipo Americano	ATCC 15987
Streptococcus salivarius TOVE-R
Streptococcus mitis	Colección de Cultura de Tipo Americano	ATCC 49456
Streptococcus sanguinis	Colección de bacterias BCCM/LMG	LMG 14657
Veillonella parvula	Instituto Leibniz DSMZ-Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares	DSM 2007
Streptococcus gordonii	Colección de Cultura de Tipo Americano	ATCC 49818
LÍNEAS CELULARES
Celdas Caco-2	Colección Europea de Cultivos Celulares Autenticados	86010202
Celdas HT29-MTX	Colección Europea de Cultivos Celulares Autenticados	12040401
REACTIVOS Y CONSUMIBLES
Caldo de Infusión Cerebro-Corazón (BHI)	Oxóide	CM1135
Blood Agar 2	Oxóide	CM0055	Medio de ágar sanguíneo
Menadione	Sigma	M9429
Hemin	Sigma	H9039
5% de sangre de caballo defibrinada estéril	E&O Laboratories Ltd,	P030
InnuPREP PCRpure Kit	Analytik Jena	845-KS-5010250	Kit de purificación PCR
Big Dye	Biosistemas Aplicados	4337454	Tinte para secuenciación
Kit de secuenciación de ciclos ABI Prism BigDye Terminator v3.1	Biosistemas Aplicados	4337456
SYBR Green I	Invitrogen	S7585
Yoduro de propidio	Invitrogen	P1304MP
Frascos de cultivo T25 sin recubrir, tratados con cultivo celular, ventilados, estériles	VWR	734-2311
Solución de tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924-100ML
Solución Trippan Blue0,4%, líquido, filtrado por estéril	Sigma-Aldrich	T8154
Fosfato tampón-solución salina (PBS)	Gibco	14190250
Medios de cultivo celular DMEM, con GlutaMAX y Piruvato	Tecnologías vitales	31966-047
Inserciones de cultivo celular de membrana poliéstera Corning Transwell	Sigma-Aldrich	CLS3450-24EA
Mucina del estómago porcino tipo II	Sigma-Aldrich	M2378
Suero fetal bovino inactivado	Greiner Bio One	758093
Antibiótico-Antimicoótico (100X)	Gibco	15240062
Triton X 100 para biología molecular	Sigma-Aldrich	T8787
DPBS sin calcio ni magnesio	Gibco	14190-250
Kit de ensayo de citotoxicidad Pierce LDH	Thermo Fisher Scientific	88953
Pozo Transwell-24 de Corning HTS, tamaño de poro 0,4 μm	Corning Costar Corp	3450
Agua libre de nucleasas	Electroforesis Serva	28539010
EQUIPAMIENTO
Mejora de la cámara de conteo de Neubauer	Carl Roth	T729.1
Citómetro de flujo BD Accuri C6	BD Biociencias	653118
PowerLyzer 24 Homogeneizador	MoBio	13155
Ciclador térmico T100	BioRad	186-1096
Sistema de rasado	Hechos a medida	-
Incubadora InnOva 4080	Científica de Nuevo Brunswick	8261-30-1007	Shaker para 2.10
Incubadora de CO₂ Memmert	Memmert GmbH & Co.	ICO150med
Millicell ERS (Sistema de Resistencia Eléctrica)	EMD Millipore, Merck KGaA	MERS00002
Millipore Milli-Q academic, sistema de agua ultra pura	Millipore, Merck KGaA	-
Shaker (ROCKER 3D básico)	IKA	4000000	Shaker para 6.10