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1. Aislar ADN genómico de tejido vegetal utilizando un kit de extracción genómica
- Obtén tejido foliar de cítricos cortando una hoja entera fresca de un árbol cítrico con tijeras limpias y coloca la hoja en una bolsa de plástico limpia para bocadillo.
NOTA: La bolsa que contiene el tejido foliar debe colocarse en un frigorífico a 4 °C o sobre hielo en un recipiente aislado lo antes posible tras la recogida para evitar que se estropee. - Añade una pequeña cantidad de nitrógeno líquido para enfriar un mortero y un mano. Mientras se enfrían, usa tijeras para cortar un pequeño trozo de tejido foliar, de aproximadamente 1 pulgada cuadrada. Coloca el tejido cortado en el mortero para congelarlo al instante. Añade más nitrógeno líquido, si es necesario.
NOTA: Se deben llevar siempre guantes aislantes al manipular nitrógeno líquido. - Tritura rápidamente el tejido vegetal hasta convertirlo en un polvo fino usando el mortero. Sigue moliendo hasta que el nitrógeno líquido se evapore por completo y quede un polvo verde fino.
- Enfría brevemente una espátula metálica en nitrógeno líquido durante 10 - 15 segundos, luego recoge el tejido molido dentro del mortero en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL, usando la espátula.
- Añade 600 μL de Solución de Lisis Nucleial (véase Tabla de Materiales) usando una pipeta de 1000 μL. Haz un vórtice de la muestra durante 1 - 3 segundos, luego incuba en un baño maria a 65 °C durante 15 minutos.
- Añade 3 μL de solución RNasa al lisato usando una pipeta de 10μL, invierte el tubo 2 a 5 veces para mezclarlo e incuba a 37 °C en una incubadora de armario durante 15 minutos.
NOTA: Deja que la mezcla se enfríe hasta la temperatura ambiente antes de continuar. - Añade 200 μL de solución de precipitación de proteínas, vórtice a alta velocidad durante 20 s y luego centrifuga durante 3 minutos a 13.000 x g para formar una pellet firme. Mientras la muestra se centrifuga, añadir 600 μL de isopropanol a temperatura ambiente a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL nuevo.
- Utilizando una pipeta de 1000 μL, retira cuidadosamente el sobrenadante de la muestra centrifugada, transfiriéndolo al tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contiene isopropanol. La bolita ahora puede desecharse.
NOTA: Evita contaminar el sobrenadante con proteína dejando una cantidad minúscula de sobrenadante sobre el pellet. - Invierte el tubo hasta que el ADN sea visible como una masa de hebras filiformes, luego centrifuga a 13.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
- Decantar el sobrenadante, añadir 600 μL de etanol al 70% al pellet, invertir el tubo varias veces para lavar el ADN y centrifugar a 13.000 x g durante 1 minuto.
- Aspira cuidadosamente el etanol, dejando la pelota suelta de ADN, luego abre e invierte el tubo, dejándolo sobre papel absorbente. Seca al aire a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Añade 100 μL de solución de rehidratación de ADN al bolíto de ADN seco, luego incuba el ADN en un baño de agua a 65 °C durante 1 hora, mezclando periódicamente golpeando el tubo.
- Colocar 1 μL de agua purificada en una microcuveta e insertarla en un espectrofotómetro para usarla como un blank. Calcula la concentración de ADN presente colocando 1 μL de la muestra en la microcuveta e insertándola en el espectrofotómetro. La concentración de ADN (ng/μL) puede calcularse como (A260 -A 320) × factor de dilución × 50 ng/μL.
NOTA: El protocolo puede pausarse aquí. La muestra puede almacenarse a 4 °C.