Este video demuestra la producción de pseudovirus de influenza en células humanas mediante la transfección de plásmidos mediada por fosfato de calcio, lo que permite la generación segura de partículas virales de un solo ciclo para aplicaciones posteriores, como ensayos de neutralización de anticuerpos bajo condiciones de nivel de bioseguridad 2.
Artículo de método
Producción de pseudovirus mediante transfección de plásmidos en células humanas
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31 de agosto de 2026
En este artículo
Resumen
Protocolo
1. Empaquetamiento de pseudovirus mediante transfección con fosfato de calcio
- Prepare suspensiones de células individuales de células HEK293FT (9 x 105 por mL) en medio DMEM (Medio de Eagle Modificado por Dulbecco) completo (Tabla 1). Añada 10 mL de la suspensión celular individual a un frasco T75 y incube las células en un incubador a 37 °C con 5% de dióxido de carbono (CO2) durante 20 h antes de la transfección.
NOTA: Se recomienda usar células HEK293FT de bajo pase (<20 pases). Asegúrese de que la monocapa celular tenga una confluencia del 80-90%. - Sustituya el medio por 10 mL de medio completo fresco que contenga cloroquina (100 µM) 2 h antes de la transfección.
- Mezcle los reactivos y el ADN plasmídico según se indica en la Tabla 2 y la Figura 1: ddH2O (agua doblemente destilada), pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ8.9, CaCl2 2,5 M (cloruro de calcio) y tampón HEPES 2x (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico). Aspire y expulse suavemente 5 veces con la pipeta; incube la mezcla a temperatura ambiente (TA) durante 20 min.
- Transfiera la mezcla al medio sobre las células y mueva suavemente el frasco. Incube las células en el incubador celular durante 15 h.
- Sustituya el medio por 15 mL de medio DMEM completo fresco. Incube las células en un incubador a 37 °C con 5% de CO2 durante 65 h.
NOTA: El color del medio será anaranjado claro o ligeramente amarillento, y al menos el 80% de las células debe mostrar el efecto citopático (CPE) bajo el microscopio invertido de luz. - Recoja el sobrenadante y centrifúguelo a 2095 x g durante 20 min a 4 °C. Recopile el sobrenadante, divídalo en alícuotas y almacénelo a -80 °C.
Tabla 1: Composición del medio DMEM completo.
| Composición del medio DMEM completo | Concentración |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | 1x |
| Suero bovino fetal | 10% |
| Penicilina (1 U/mL)/Estreptomicina | 1 μg/ mL |
Tabla 2: Sistema de empaquetamiento de pseudovirus.
| Materiales | Concentración | Volumen |
| 2x HEPES (pH 7.1) | -- | 675.0 μL |
| CaCl2 (2.5 M) | -- | 67.5 μL |
| ddH2O | -- | 529.2 μL |
| pCMV Δ 8.9 | 1000 ng/μL | 18.9 μL |
| pCMV/R-HA | 100 ng/μL | 27.0 μL |
| pCMV/R-NA | 50 ng/μL | 13.5 μL |
| pHR-Luc | 1000 ng/μL | 18.9 μL |
Resultados
Figura 1: Diagrama de flujo de la transfección mediada por calcio. Este diagrama de flujo se utiliza para describir los principales procedimientos de la transfección mediada por calcio.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cloruro de calcio anhidro | AMRESCO | 1B1110-500G | Reactivo |
| Cloroquina difosfato | Selleck | S4157 | Reactivo |
| Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reactivo |
| Suero bovino fetal | Gibco | 16000-044 | Reactivo |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Línea celular |
| ÁCIDO HEPES LIBRE | AMRESCO | 0511-250G | Reactivo |
| ELISA para antígeno p24 del VIH-1 | ZeptoMetrix | 801111 | Kit de reactivos |
| Paquete refrigerante para sistema de ensayo de luciferasa | Promega | E4530 | Kit de reactivos |
| Tubos microcentrífugos 1,5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | material de consumo |
| Tubos cónicos centrífugos Nunc 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | material de consumo |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140-122 | Reactivo |
| Puntas de pipeta (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | material de consumo |
| Puntas de pipeta (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | material de consumo |
| Puntas de pipeta (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | material de consumo |
| Pipetas serológicas (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | material de consumo |
| Pipetas serológicas (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | material de consumo |
