Silenciamiento de microARN basado en el Virus X de la Patata en plantas de patata

En este artículo

Resumen

Fuente: Zhao, J., et al. Silenciamiento de microARN basado en el virus X de la papa (VbMS) en papa. J. Vis. Exp. (2020).

Este video demuestra el uso de Agrobacterium tumefaciens para entregar un constructo basado en el Virus X de la Papa (PVX) a plantas de papa cultivadas in vitro, con el fin de lograr el silenciamiento de microARN mediado por virus (VbMS). El método permite la supresión sistémica de un microARN diana, lo que posibilita a los investigadores estudiar su función en el desarrollo de la planta mediante cambios fenotípicos observables.

Protocolo

1. Realizar el ensayo VbMS basado en PVX en plantas de papa.

Transplante plantas de papa in vitro de 4 semanas de edad a suelo. Las plantas trasplantadas se someterán al ensayo VbMS 3–4 días después.
Inocule plantas de papa con Agrobacterium que contenga los plásmidos PVX-STTM (Mimético de Objetivo en Tándem Corto).
NOTA: Para el ensayo VbMS en papa, la infiltración mediada por Agrobacterium y la inoculación mediante rayado con palillo se realizan simultáneamente.
1. Seleccione e inocule transformantes positivos que contengan vectores PVX-STTM en 50 mL de caldo LB líquido que contenga 50 μg/mL de kanamicina y 50 μg/mL de rifampicina. Incube a 28 °C en un agitador a 220 rpm durante 16 h hasta que OD₆₀₀ = 1,0.
2. Al mismo tiempo, estrée colonias positivas de Agrobacterium en al menos dos nuevas placas de LB que contengan 50 μg/mL de kanamicina y 50 μg/mL de rifampicina, y crezca a 28 °C durante 1 día. Incluya el vector PVX-LIC como control y PVX-GFP para monitorear la diseminación del virus.
3. Recoja el cultivo líquido de Agrobacterium mediante centrifugación a 3.400 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Re-suspenda las células de Agrobacterium con un volumen igual de tampón de infiltración (10 mM MgCl₂, 10 mM MES y 200 µM acetosiringona, pH = 5,6) y ajuste a OD₆₀₀ = 1,0. Incube a temperatura ambiente durante 6 h.
4. Infiltra el cultivo de Agrobacterium en la cara abaxial de hojas completamente expandidas utilizando una jeringa de 1 mL sin aguja.
  1. Gire y sostenga una hoja con una mano, luego use un dedo para apoyar la lámina foliar desde el lado adaxial en el sitio de infiltración. Mantenga la jeringa en posición vertical respecto a la superficie de la hoja con la otra mano e infiltre el cultivo de Agrobacterium en la cara abaxial de la lámina.
5. Rasque el cultivo de Agrobacterium de las placas de LB y raye la superficie del tallo en el primer o segundo entrenudo de las plantas de papa infiltradas con un palillo. Raye suavemente la epidermis del tallo. Evite atravesar el tallo, ya que podría causar daños severos a las plantas.
Cultive las plantas infiltradas a 22 °C con un fotoperiodo de 16 h luz/8 h oscuridad y una intensidad lumínica de 120 μmol/m²∙ s¹ en un invernadero.
NOTA: Los fenotipos causados por el silenciamiento de miARN generalmente aparecen entre 2 y 4 semanas después de la inoculación (Figura 1, Figura 2). Normalmente tarda entre 10 y 20 días en aparecer el fenotipo VbMS tras la infiltración. El fenotipo VbMS depende de las propiedades del miARN específico y de los genes diana, las condiciones de crecimiento y las variedades de papa.

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Resultados

Figura 1: Silenciamiento mediado por virus (VbMS) de miR165/166 en la variedad tetraploide de papa Katahdin. Fenotipos de las plantas de papa (Katahdin) que expresan el vector control PVX o PVX-STTM165/166. Las flechas magenta indican estru...