Preparación de criosecciones retinianas de ratón para evaluar la permeabilidad retiniana al virus adenoasociado

En este artículo

Resumen

Fuente: Vacca, O., et al. Uso del virus asociado a adenovirus como herramienta para estudiar las barreras retinianas en enfermedades. J. Vis. Exp. (2015)

Este video demuestra el procedimiento paso a paso para preparar criosecciones de retina de ratón con el fin de visualizar la permeabilidad del virus asociado a adenovirus a través de barreras retinianas alteradas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras animales han sido revisados y aprobados por el comité de ética animal correspondiente.

Para secciones criostáticas de retina (Figura 1), diseccionar los ojos enucleados para eliminar el cristalino y la córnea, y fijar por inmersión en paraformaldehído al 4 % durante 1 h.
1. Crioprotectar los ojos previamente fijados en sacarosa al 10 % durante 1 h a temperatura ambiente, en sacarosa al 20 % durante otra hora a temperatura ambiente. Crioprotectar en solución de sacarosa al 30 %, durante la noche a 4 °C. Congelar e incluir las copas oculares en resina de inclusión como Cryo-matrix. Realizar secciones criostáticas de 10 µm y montarlas en portaobjetos especialmente tratados para secciones de tejido congelado que mejoran la adherencia del tejido durante la tinción.
2. Permeabilizar las secciones con Triton X-100 al 0,1 % en solución salina tamponada con fosfatos (PBS) pH 7,4 durante 5 min. Lavar 2 veces en PBS y bloquear durante 1 h a temperatura ambiente en PBS con albúmina sérica bovina (BSA) al 1 % y Tween 20 al 0,1 %.

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Resultados

Figura 1: Representación esquemática del protocolo general. Tras la producción del virus asociado a adenovirus (AAV), las partículas se inyectan en el vítreo o en la vena peniana para anestesiar ratones adultos. Se realizan imágenes del fond...