Preparación de criosecciones retinianas de ratón para evaluar la permeabilidad retiniana al virus adenoasociado

Resumen

Fuente: Vacca, O., et al. Uso del virus asociado a adenovirus como herramienta para estudiar las barreras retinianas en enfermedades. J. Vis. Exp. (2015)

Este video demuestra el procedimiento paso a paso para preparar criosecciones de retina de ratón con el fin de visualizar la permeabilidad del virus asociado a adenovirus a través de barreras retinianas alteradas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras animales han sido revisados y aprobados por el comité de ética animal correspondiente. 

1. Para secciones criostáticas de retina (Figura 1), diseccionar los ojos enucleados para eliminar el cristalino y la córnea, y fijar por inmersión en paraformaldehído al 4 % durante 1 h.
   1. Crioprotectar los ojos previamente fijados en sacarosa al 10 % durante 1 h a temperatura ambiente, en sacarosa al 20 % durante otra hora a temperatura ambiente. Crioprotectar en solución de sacarosa al 30 %, durante la noche a 4 °C. Congelar e incluir las copas oculares en resina de inclusión como Cryo-matrix. Realizar secciones criostáticas de 10 µm y montarlas en portaobjetos especialmente tratados para secciones de tejido congelado que mejoran la adherencia del tejido durante la tinción.
   2. Permeabilizar las secciones con Triton X-100 al 0,1 % en solución salina tamponada con fosfatos (PBS) pH 7,4 durante 5 min. Lavar 2 veces en PBS y bloquear durante 1 h a temperatura ambiente en PBS con albúmina sérica bovina (BSA) al 1 % y Tween 20 al 0,1 %.

Resultados

Figura 1: Representación esquemática del protocolo general. Tras la producción del virus asociado a adenovirus (AAV), las partículas se inyectan en el vítreo o en la vena peniana para anestesiar ratones adultos. Se realizan imágenes del fondo del ojo con una cámara Micron III para seguir la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP). El patrón de expresión de GFP se analiza en cortes criostáticos de retina y retinas planas mediante inmunohistoquímica e imágenes confocales. El paso del AAV a través de la barrera hematorretiniana (BRB) se evalúa mediante análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en muestras de sangre procedentes de ratones inyectados intravítreamente o intraperitonealmente, con el fin de detectar la presencia de la secuencia GFP, indicadora de partículas de AAV en la circulación sanguínea.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Resina de inclusión Cryomatrix	Thermo Scientific	6769006
Portaobjetos adhesivos Superfrost plus	Thermo Scientific	10143352
Amplificador binocular SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Zoom 0,66 x 5 LEDs con soporte epiluminiscencia y transiluminiscencia / Disección de retinas
Tijeras de resorte rectas - 8,5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	Disección retiniana