Entrega de genes mediada por AAV para la visualización de la pérdida de integridad de la membrana retiniana

En este artículo

Resumen

Fuente: Vacca, O., et al. Uso del virus asociado a adenovirus como herramienta para estudiar las barreras retinianas en la enfermedad. J. Vis. Exp. (2015).

Este video demuestra el método de entrega génica mediada por AAV en una retina de ratón transgénico, seguido del disección del tejido y tinción para evaluar la integridad de la membrana limitante interna.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras animales han sido revisados y aprobados por el comité de ética animal correspondiente.

1. Inmunohistoquímica

Para montajes planos de retina (Figura 1), fije los ojos enucleados en paraformaldehído al 4% durante 15 min para facilitar la disección.
1. En 15-30 min, diseccione los ojos para eliminar la córnea y el cristalino. Separe la retina del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y de la esclerótica cortando alrededor de la ora serrata y el nervio óptico. Sumerja en paraformaldehído al 4% durante otros 30 min para fijar la retina y la proteína fluorescente en las células retinianas transducidas (la fijación no debe exceder las 24 h). Lave durante 5 min en PBS estéril, pH 7,4.
2. Cambie el tampón salino fosfato (PBS) por tampón bloqueante (PBS con albúmina sérica bovina (BSA) al 1%, suero normal de cabra o asno al 2%, Triton X-100 al 0,5%) e incube en el tampón bloqueante durante 4 h a temperatura ambiente o a 4 °C durante la noche.
Incube los tejidos con anticuerpos primarios en tampón bloqueante durante 4 h a temperatura ambiente o a 4 °C durante la noche. Lave 3 veces con PBS.
NOTA: Los anticuerpos utilizados son los siguientes: anti-laminina (1/1.000) que marca las membranas limitantes internas (ILM), anticuerpo monoclonal anti-rodopsina 4D2 (1/500) que marca los bastones, anticuerpo monoclonal anti-sintetasa de glutamina GS-6 (1/1.500) que marca las células de Müller, lectina de aglutinina de maní (PNA) (1/40) que marca los conos.
Incube los tejidos con una dilución 1:500 de anticuerpos secundarios conjugados con alexa fluor en tampón bloqueante durante 1 h (secciones criostáticas) o 2 h (montajes planos) a temperatura ambiente y protegido de la luz. Lave 3 veces con PBS.
Realice cortes de alivio en la retina y monte esta plana sobre un portaobjetos con el lado de los fotorreceptores o de las células ganglionares de la retina (RGC) hacia arriba. Añada medio acuoso de montaje, coloque una cubreobjetos y almacene a 4 °C.
Realice microscopía confocal en un microscopio confocal de barrido láser. Adquiera las imágenes secuencialmente, línea por línea, para reducir la interferencia entre excitación y emisión. Defina el tamaño del paso según el teorema de muestreo de Nyquist-Shannon. Utilice ajustes de exposición que minimicen los píxeles sobrexplotados en las imágenes finales. Procese imágenes de 12 bits con FIJI, proyecte las secciones Z en un plano único utilizando la intensidad máxima mediante la función Z-project y, finalmente, convierta al modo de color RGB de 8 bits.

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Resultados

Figura 1: Representación esquemática del protocolo general. Tras la producción del AAV, las partículas se inyectan en el vítreo o en la vena peniana para anestesiar ratones adultos. Se realizan imágenes del fondo de ojo con una cámara Micron...