Entrega de genes mediada por AAV para la visualización de la pérdida de integridad de la membrana retiniana

En este artículo

Resumen

Fuente: Vacca, O., et al. Uso del virus asociado a adenovirus como herramienta para estudiar las barreras retinianas en la enfermedad. J. Vis. Exp. (2015).

Este video demuestra el método de entrega génica mediada por AAV en una retina de ratón transgénico, seguido del disección del tejido y tinción para evaluar la integridad de la membrana limitante interna.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras animales han sido revisados y aprobados por el comité de ética animal correspondiente.

1. Inmunohistoquímica

Para montajes planos de retina (Figura 1), fije los ojos enucleados en paraformaldehído al 4% durante 15 min para facilitar la disección.
1. En 15-30 min, diseccione los ojos para eliminar la córnea y el cristalino. Separe la retina del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y de la esclerótica cortando alrededor de la ora serrata y el nervio óptico. Sumerja en paraformaldehído al 4% durante otros 30 min para fijar la retina y la proteína fluorescente en las células retinianas transducidas (la fijación no debe exceder las 24 h). Lave durante 5 min en PBS estéril, pH 7,4.
2. Cambie el tampón salino fosfato (PBS) por tampón bloqueante (PBS con albúmina sérica bovina (BSA) al 1%, suero normal de cabra o asno al 2%, Triton X-100 al 0,5%) e incube en el tampón bloqueante durante 4 h a temperatura ambiente o a 4 °C durante la noche.
Incube los tejidos con anticuerpos primarios en tampón bloqueante durante 4 h a temperatura ambiente o a 4 °C durante la noche. Lave 3 veces con PBS.
NOTA: Los anticuerpos utilizados son los siguientes: anti-laminina (1/1.000) que marca las membranas limitantes internas (ILM), anticuerpo monoclonal anti-rodopsina 4D2 (1/500) que marca los bastones, anticuerpo monoclonal anti-sintetasa de glutamina GS-6 (1/1.500) que marca las células de Müller, lectina de aglutinina de maní (PNA) (1/40) que marca los conos.
Incube los tejidos con una dilución 1:500 de anticuerpos secundarios conjugados con alexa fluor en tampón bloqueante durante 1 h (secciones criostáticas) o 2 h (montajes planos) a temperatura ambiente y protegido de la luz. Lave 3 veces con PBS.
Realice cortes de alivio en la retina y monte esta plana sobre un portaobjetos con el lado de los fotorreceptores o de las células ganglionares de la retina (RGC) hacia arriba. Añada medio acuoso de montaje, coloque una cubreobjetos y almacene a 4 °C.
Realice microscopía confocal en un microscopio confocal de barrido láser. Adquiera las imágenes secuencialmente, línea por línea, para reducir la interferencia entre excitación y emisión. Defina el tamaño del paso según el teorema de muestreo de Nyquist-Shannon. Utilice ajustes de exposición que minimicen los píxeles sobrexplotados en las imágenes finales. Procese imágenes de 12 bits con FIJI, proyecte las secciones Z en un plano único utilizando la intensidad máxima mediante la función Z-project y, finalmente, convierta al modo de color RGB de 8 bits.

Resultados

Figura 1: Representación esquemática del protocolo general. Tras la producción del AAV, las partículas se inyectan en el vítreo o en la vena peniana para anestesiar ratones adultos. Se realizan imágenes del fondo de ojo con una cámara Micron III para seguir la expresión de la GFP (proteína verde fluorescente). El patrón de expresión de la GFP se analiza en criosecciones retinianas y en retinas montadas en plano mediante inmunohistoquímica e imágenes confocales. El paso del AAV a través de la BHE (barrera hematorretiniana) se evalúa mediante análisis de PCR en muestras de sangre procedentes de ratones inyectados intravítreamente o intrapenianamente, con el fin de detectar la presencia de la secuencia GFP, un indicador de la presencia de partículas de AAV en la circulación sanguínea.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Láminas adhesivas Superfrost Plus	Thermo Scientific	10143352	Láminas
Anti-laminina	Sigma	L9393	Anticuerpo
Anti-rhodopsina clon 4D2	Millipore	MABN15	Anticuerpo
Anti-sintetasa de glutamina clon GS-6	Millipore	MAB302	Anticuerpo
Proteína ácida fibrilar glial anti-GFAP	Dako	334	Anticuerpo
Lectina PNA	Invitrogen	L32459	Sonda
Anticuerpos secundarios conjugados con Alexa fluor	Invitrogen		Anticuerpo
Reactivo Fluorsave	Calbiochem	345789	Medio de montaje
Dye azul de Evans	Sigma	E2129	Tinte
Formamida espectrofotométrica	Sigma	295876-2L
Fluoresceína	Sigma	F2456	Tinte
Micron III	Phoenix Research Labs		Sistema de microscopía basado en una cámara de color 3-CCD, capturador de fotogramas y software comercial que permite a los investigadores obtener imágenes de retinas de ratón.
Lupa binocular SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Zoom 0.66 x 5 x LEDs con soporte epi y dia / Disección de retinas
Tijeras de resorte rectas - 8,5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	Disección retiniana