Producción y purificación de partículas recombinantes del virus de la hepatitis B

Resumen

Fuente: Nishitsuji, H., et al. Desarrollo de un sistema de reportero del virus de la hepatitis B para monitorear las primeras etapas del ciclo de replicación. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra la producción y purificación de partículas recombinantes del virus de la hepatitis B, permitiendo preparaciones virales seguras y deficientes en replicación para estudiar los eventos iniciales de la infección y para aplicaciones de cribado de alto rendimiento de fármacos antivirales.

Protocolo

1. Producción del VHB recombinante (virus de la hepatitis B) que codifica la proteína reportera

1. Preparación de células HepG2
   1. Prepare el medio de cultivo celular (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de aminoácidos no esenciales).
   2. Siembre 4 x 10⁶ células HepG2 (carcinoma hepatocelular humano G2) en un plato recubierto con colágeno de 10 cm en 10 ml de medio de cultivo el día anterior a la transfección. Incube las células HepG2 a 37 °C en un incubador con 5% de CO₂ humedecido.
      NOTA: Cuando aproximadamente 4 x 10⁶ células HepG2 se siembran en un plato recubierto con colágeno de 10 cm en 10 ml de medio de cultivo, estarán entre un 70-90% confluentes al día siguiente.
2. Transfección
   1. Transfecte las células HepG2 con 5 µg del plásmido pUC1.2HBV delta epsilon15 (un plásmido de replicación del VHB con una deleción en la secuencia épsilon) y 5 µg de pUC1.2HBV/NL15 utilizando un reactivo de transfección según las instrucciones del fabricante.
   2. Al día siguiente, retire el medio de cultivo y agregue 10 ml de medio de cultivo fresco.
   3. Una semana después de la transfección, transfiera el medio de cultivo que contiene el VHB recombinante a un tubo de 50 ml y continúe con el paso 1.3.1. Agregue 10 ml de medio de cultivo fresco al plato que contiene las células transfectadas.
      NOTA: La producción del VHB recombinante se mantiene durante 4 semanas. El medio de cultivo que contiene el VHB recombinante puede almacenarse a 4 °C durante 1 mes.
3. Purificación del VHB recombinante
   1. Elimine los restos celulares del medio de cultivo que contiene el VHB recombinante mediante centrifugación (2.300 x g durante 5 min).
   2. Pase el sobrenadante a través de un filtro de membrana de 0,45 µm.
   3. Agregue un volumen igual de PEG al 26% / NaCl 1,5 M (polietilenglicol 6000: 130 g, NaCl (cloruro de sodio), 49 g, 1 ml de EDTA 0,5 M (ácido etilendiaminotetraacético) pH 8,0 y 5 ml de HEPES 1 M (N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico) pH 7,6 en 500 ml) al medio de cultivo que contiene el VHB recombinante y mezcle suavemente. Incube durante la noche a 4 °C.
   4. Centrifugue a 2.300 x g durante 20 min a 4 °C.
   5. Descarte el sobrenadante y disuelva el precipitado en 0,5 ml de TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
   6. Elimine los restos mediante centrifugación a 2.300 x g durante 5 min.
   7. Cargue 0,5 ml de TNE que contiene el VHB recombinante sobre 0,8 ml de sacarosa al 20% en TNE.
   8. Centrifugue a 100.000 × g durante 3 h a 15 °C.
   9. Descarte la mayor cantidad posible del sobrenadante y conserve el precipitado. Re suspenda en 1 ml de DMEM libre de suero por cada 40 ml de medio de cultivo inicial.
   10. Incube durante la noche a 4 °C.
   11. Filtre a través de un filtro de 0,45 µm. Prepare alícuotas de 0,5 ml y almacénelas a -80 °C.
       NOTA: Si se observa contaminación con proteína reportera en la muestra original del virus, purifique el virus mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa al 5-30% en TNE a 100.000 x g durante 2 h, o mediante centrifugación en equilibrio de densidad con CsCl (cloruro de cesio) desde 1,1-1,6 g/ml a 150.000 x g durante 50 h.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo del ensayo de luciferasa Nano-Glo	Promega	N1110
Solución mixta de penicilina-estreptomicina	Nacalai tesque	09367-34
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Placa de 100 mm recubierta con colágeno	Iwaki	4020-010
Reactivo de transfección Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Polietilenglicol (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Polietilenglicol (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
Solución de EDTA 0,5 mol/L	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, filtro de 0,45 μm, poliéter sulfona	Merck Millipore	SLHP033RS
DMSO (dimetilsulfóxido)	Sigma-Aldrich	D2650
Placa de 96 pocillos recubierta con colágeno	Corning	NO3585
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-
pUC1.2HBV/NL	-	-