Silenciamiento génico mediado por densovirus recombinante en larvas de mosquito

Resumen

Fuente: Liu, P., et al. Uso de un densovirus recombinante de mosquito como vector de entrega de genes para el análisis funcional de genes en larvas de mosquito. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra el uso de densovirus de mosquito recombinantes que codifican microARN para silenciar genes específicos en larvas de mosquito. Las larvas de primer estadio infectadas producen microARN funcionales que suprimen la expresión del gen diana para estudios posteriores.

Protocolo

1. Transducción de mosquitos

1. Lave tres veces 100 larvas de primer estadio de Aedes albopictus con agua desionizada y, luego, transfiera las larvas a un vaso de precipitados que contenga 95 mL de agua desionizada. Añada 5 mL de los cultivos del densovirus recombinante de Aedes aegypti (rAaeDV) (concentración final de 1,00 x 10¹⁰ copias/mL).
2. Incube durante 24 h a 28 °C, lave las larvas tres veces con agua desionizada y, luego, transfiera nuevamente las larvas a las placas y alimente regularmente.
3. Monitoree el nivel de expresión del gen diana en las larvas mediante qPCR o inmunotransferencia (Western blot).
   NOTA: El método de detección de señal de fluorescencia puede utilizarse para aislar las larvas infectadas de manera más precisa. Por ejemplo, para detectar señales fluorescentes en larvas infectadas con un virus recombinante que expresa DsRed, las larvas pueden colocarse sobre un portaobjetos con cavidad y observarse bajo un microscopio de fluorescencia invertido cada 8 h hasta 2 días posteriores a la infección. Una vez detectadas las larvas fluorescentes, deben separarse en vasos de plástico individuales para permitir una observación continua posterior. Mediante este método pueden identificarse larvas con múltiples tejidos infectados.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Centrífuga	Thermo Scientific	75004260
Sistema de centrífuga	Beckman Coulter	363118
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	Beijing Tiangen Biotech	FP205