Visualización de cápsides virales sometidas a tratamiento térmico mediante microscopía electrónica de transmisión

Resumen

Fuente: Moore, M. D., et al. Métodos Alternativos In Vitro para la Determinación de la Integridad Estructural del Capsido Viral. J. Vis. Exp.(2017).

Este video demuestra cómo los capsidos virales purificados se someten a tratamiento térmico, se preparan y se visualizan mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) para revelar cambios estructurales y daños inducidos por el calor.

Protocolo

1. Preparación de muestras para TEM
   1. Obtenga rejillas con película de soporte de carbono (níquel) diseñadas para TEM.
      NOTA: Consulte con el laboratorio central sobre los reactivos recomendados y su manejo para usar con el microscopio del laboratorio. Asegúrese de almacenar las rejillas en una caja que contenga un agente desecante o en una cámara al vacío para minimizar la exposición a la humedad.
   2. Desgarre trozos de papel filtro de aproximadamente 5 cm x 5 cm. Obtenga placas de Petri de vidrio y pinzas reversas autorrellenables adecuadas para uso en microscopía.
   3. Corte un trozo de película de parafina de aproximadamente 2,5 cm x 5 cm. Colóquelo sobre la superficie de trabajo.
   4. Tratamiento térmico de los capsidos del norovirus GII.4 Sydney
      1. Obtenga la proteína principal del capsido del norovirus humano purificado (VP1) de GII.4 Sydney (Acceso: JX459908) ensamblado en capsidos. 
         NOTA: Los capsidos utilizados en el estudio fueron proporcionados amablemente por R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX).
      2. Diluya los capsidos en ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) 10 mM (pH 7,4) hasta un volumen máximo de 15 µL en tubos individuales para reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con tapa. Asegúrese de que el tubo contenga al menos 600 ng de capsido. Asegúrese de que haya 600 ng de capsido por combinación tratamiento-ligando.
      3. Precale el termociclador a la temperatura deseada para el tratamiento térmico. 
         NOTA: Para este protocolo, se eligió un tratamiento a 68 °C durante diferentes tiempos (0 - 25 min).
      4. Precale otro termociclador a 4 °C para enfriamiento inmediato. Añada los tubos con la solución de capsido al termociclador durante el tiempo deseado. Transfiera inmediatamente a un termociclador preenfriado a 4 °C durante 5 min tras el calentamiento.
      5. Centrifugue brevemente para hacer descender todas las gotas al fondo del tubo.
      6. Transfiera mediante pipeta toda la gota de ~15 µL de la solución de capsido tratada sobre la película de parafina.
   5. Agarre el borde de la rejilla con pinzas, permitiendo que estas se cierren sobre el borde para sostener la rejilla, y coloque la rejilla con el lado de carbono hacia abajo sobre la gota de la solución tratada. Incube durante 10 min para permitir que el capsido se adhiera a la rejilla.
      1. Dependiendo de la pureza de la preparación del capsido, añada lavados con la solución de HEPES 10 mM si es necesario, en forma de gotas de 10-15 µL colocadas en fila después de la gota de capsido tratado.
      2. Tras 10 min, levante la rejilla con la gota. Coloque la rejilla casi perpendicularmente sobre un trozo de papel filtro para absorber la gota. Tome la gota de tampón HEPES de 10 - 15 µL con la rejilla, manténgala durante 30 s y luego absorba con otro trozo de papel filtro para lavar.
   6. Coloque una gota de 15 µL de solución de acetato de uranilo al 2 % sobre la película de parafina en un área vacía.
      1. Levante la gota de acetato de uranilo con la rejilla y manténgala durante 45 s. Absorba el acetato de uranilo, asegurándose de eliminar la mayor parte de la solución. Coloque la rejilla con el lado de carbono hacia arriba sobre un trozo de papel filtro, teniendo cuidado de que la rejilla no se "pegue" a la humedad de las pinzas. Coloque el papel filtro con la rejilla sobre una placa de Petri de vidrio abierta.
         NOTA: No utilice placas de Petri de plástico, ya que las rejillas se verán electrostáticamente atraídas hacia ellas y se quedarán pegadas al recipiente.
   7. Repita el procedimiento para todos los tratamientos. Coloque las mitades de las placas de Petri con las rejillas en un desecador durante la noche para secarlas antes de observarlas con TEM.
   8. Consulte con el laboratorio de microscopía de la institución correspondiente sobre la observación de las rejillas preparadas. Algunos laboratorios permiten que el usuario reciba formación en el uso del instrumento del laboratorio. Los detalles específicos sobre la configuración y observación de un microscopio determinado están fuera del alcance de este artículo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Preparación de muestras para microscopía electrónica de transmisión
Parrillas de microscopía electrónica de níquel con película de soporte de carbono	Ladd Research	10880-100
Pinzas electrónicas de cierre automático invertidas para microscopía electrónica	Ted Pella	5372-NM
Papel de filtro cualitativo	Sigma-Aldrich (Whatman)	WHA1002055
Placas de Petri de vidrio	Sigma-Aldrich	BR455743
Solución stock de HEPES 100 mM (pH 7.2)	N/A	N/A
Acetato de uranilo al 2%	N/A	N/A