Entrega de genes mediada por bacteriófagos en bacterias espiroquetas

Resumen

Fuente: Eggers, C. H. Manipulación genética mediada por fagos del espiroqueta de la enfermedad de Lyme Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).

Este video demuestra la transducción de espiroquetas de Borrelia modificadas genéticamente mediante bacteriófagos no infecciosos, precipitados con polietilenglicol, que portan un plásmido de resistencia a la kanamicina. Tras la incubación con las bacterias, el cultivo se siembra en un medio suplementado con antibiótico. Solo las células que reciben el plásmido sobreviven y forman colonias. Estas colonias se seleccionan y amplifican luego en medio líquido que contiene antibiótico para establecer una población bacteriana estable que portará el plásmido, destinada a aplicaciones posteriores

Protocolo

1. Ensayo de transducción tras la precipitación con PEG (polietilenglicol) del bacteriófago φBB-1

1. Preparar B. burgdorferi cultivos que se utilizarán como receptores en los ensayos de transducción. Con base en la densidad determinada, calcule el volumen de cultivo del receptor necesario para obtener 15 mL de 1 × 107 espiroquetas·mL−1
2. Centrifugar el volumen del cultivo a 6.000 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 14,5 mL de BSK (Barbour-Stoenner-Kelly) fresco.
3. Añadir ≤500 µL de muestra de fago precipitado con PEG al cultivo del clon receptor. Mezclar bien e incubar a 33 °C durante 72....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos cónicos para centrífuga de 15 mL (polipropileno)	USA Scientific	5618-8271
Mitomicina C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	PRECAUCIÓN: posible carcinógeno; usar únicamente en una campana extractora de gases químicos
Pipetas Pasteur de 5,75" (con tapón de algodón/vidrio borosilicato/no estériles)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	Esterilizar en autoclave antes de usar
Tubos cónicos para centrífuga de 50 mL (polipropileno)	USA Scientific	1500-1211
Etileno absoluto
Eritromicina	Research Products International Corp	E57000-25.0
Solución reactiva de gentamicina	Gibco	15750-060
Glucosa (dextrosa anhidra)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Sulfato de kanamicina	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0