Entrega de genes mediada por bacteriófagos en bacterias espiroquetas

Resumen

Fuente: Eggers, C. H. Manipulación genética mediada por fagos del espiroqueta de la enfermedad de Lyme Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).

Este video demuestra la transducción de espiroquetas de Borrelia modificadas genéticamente mediante bacteriófagos no infecciosos, precipitados con polietilenglicol, que portan un plásmido de resistencia a la kanamicina. Tras la incubación con las bacterias, el cultivo se siembra en un medio suplementado con antibiótico. Solo las células que reciben el plásmido sobreviven y forman colonias. Estas colonias se seleccionan y amplifican luego en medio líquido que contiene antibiótico para establecer una población bacteriana estable que portará el plásmido, destinada a aplicaciones posteriores

Protocolo

1. Ensayo de transducción tras la precipitación con PEG (polietilenglicol) del bacteriófago φBB-1

1. Preparar B. burgdorferi cultivos que se utilizarán como receptores en los ensayos de transducción. Con base en la densidad determinada, calcule el volumen de cultivo del receptor necesario para obtener 15 mL de 1 × 107 espiroquetas·mL−1
2. Centrifugar el volumen del cultivo a 6.000 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 14,5 mL de BSK (Barbour-Stoenner-Kelly) fresco.
3. Añadir ≤500 µL de muestra de fago precipitado con PEG al cultivo del clon receptor. Mezclar bien e incubar a 33 °C durante 72-96 h.
   NOTA: La cantidad de fagos recuperada durante la precipitación con PEG puede ser variable, dependiendo de varios factores. Sin embargo, a partir de un cultivo de 15 mL del inductor B. burgdorferi cepas CA-11.2A, 500 µL generalmente contiene entre 50 y 1.000 fagos viables28. Volúmenes de recuperación de fagos ≥500 µL afectar negativamente B. burgdorferi crecimiento, probablemente debido al aumento en la relación de medio de suspensión (SM) respecto al BSK.
4. Realice la selección de los transductantes mediante siembra en fase sólida después de mezclar con fagos precipitados con PEG.

2. Selección de transductantes

NOTA: La siembra en fase sólida de posibles transductantes se realiza mediante una modificación de capa única del protocolo. Las colonias de B. burgdorferi crecen dentro del agar, por lo que para la selección de transductantes mediante siembra en fase sólida, las muestras deben agregarse al medio mientras se vierten las placas. Esta técnica también podría ser efectiva para la selección de transductantes, pero aún no se ha probado con este fin.

1. Determine el número de placas necesarias para la selección de transductantes según el número de muestras de los ensayos de transducción y controles que se van a sembrar.
   NOTA: Por lo general, se preparan dos placas por muestra, una equivalente a aproximadamente el 10% del volumen del cultivo y otra que incluye el resto del cultivo. Además, prepare placas que sirvan como controles negativos para probar individualmente que la preparación de fagos y/o los clones parentales utilizados como donante y receptor no crezcan en presencia del (de los) antibiótico(s) usado(s) durante la selección. También se recomienda preparar material para al menos dos placas adicionales. Por ejemplo, si el número de muestras y controles a sembrar es ocho, prepare suficiente mezcla para 10 placas.
2. Prepare las soluciones para siembra como se describe a continuación.
   NOTA: Cada placa tendrá 30 mL, compuestos por 20 mL de BSK 1,5x para siembra y 10 mL de agarosa al 2,1% (relación 2:1). Esto producirá una placa con concentraciones finales de BSK 1x y agarosa al 0,7%. Por ejemplo, para 10 placas, prepare una mezcla total de 300 mL, compuesta por 200 mL de BSK 1,5x y 100 mL de agarosa al 2,1%.
   1. Prepare 1 L de BSK 1,5x utilizando las cantidades de cada componente indicadas para BSK 1,5x. Almacénelo según se describe para BSK 1x.
   2. Prepare agarosa al 2,1% en agua y esterilice en autoclave. Utilice la solución de agarosa fresca o almacénela a temperatura ambiente. Si se almacena a temperatura ambiente, caliente en microondas con la tapa colocada flojamente hasta que esté completamente fundida antes de la siembra.
   3. Determine el volumen de antibiótico(s) necesario para alcanzar la concentración adecuada en función del volumen total de la mezcla para siembra.
      NOTA: Si el volumen total de la solución final para siembra es de 300 mL, mezcle 200 mL de BSK 1,5x y la cantidad suficiente de antibiótico para asegurar que los 300 mL totales tengan la concentración final correcta de antibiótico. Si tanto el donante como el receptor en el ensayo de transducción poseen genes de resistencia a antibióticos diferentes, la mezcla para siembra debe contener ambos antibióticos. Si el fago precipitado con PEG del donante codifica un marcador de resistencia a antibióticos y el receptor no tiene ninguno, la mezcla para siembra debe contener solo ese antibiótico.
3. Según el número de placas que se van a preparar, transfiera la cantidad adecuada de BSK 1,5x y antibiótico(s) a un frasco estéril lo suficientemente grande como para contener toda la mezcla para siembra. Equilibre en un baño de agua a 56 °C durante ≥15 min.
4. Equilibre la agarosa fundida procedente del autoclave o del microondas en un baño de agua a 56 °C durante ≥15 min.
5. Después del equilibrio, agregue la cantidad determinada de agarosa al 2,1% al frasco con el BSK 1,5x (con antibiótico) y devuelva la solución de siembra al baño de agua a 42 °C durante 10-15 min.
   NOTA: Temperaturas más altas pueden dañar o matar a los espiroquetas36. Si utiliza el mismo baño de agua que antes, enfríe el baño a 42-45 °C antes de iniciar el temporizador para el equilibrio. No permita que la solución de siembra permanezca a 42 °C más de 20 min, ya que comenzará a solidificarse durante el vertido de las placas.
6. Durante el equilibrio, prepare las muestras de B. burgdorferi que se van a sembrar. Transfiera la cantidad a sembrar a un tubo cónico estéril de centrífuga de 50 mL.
7. Si va a sembrar una cantidad menor de 1,5 mL (<5% del volumen final de 30 mL de la placa), transfiera la muestra al nuevo tubo y agregue la mezcla de siembra directamente a la muestra durante la siembra.
   1. Para volúmenes mayores, transfiera el volumen deseado de cultivo al nuevo tubo y luego centrifugue a 6.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Elimine por decantación todo el sobrenadante excepto 100-500 µL y utilice el resto para resuspender completamente el sedimento antes de la siembra.
   2. Para placas de control tras el cultivo conjunto, agregue ≥107 células de los clones donantes o receptores a tubos cónicos estériles de centrífuga de 50 mL. Si el volumen supera los 1,5 mL, centrifugue y resuspenda el sedimento. Si se realizó un ensayo de transducción utilizando el fago precipitado con PEG, además del clon receptor, agregue 100-250 µL de la muestra de fago a un tubo cónico estéril de 50 mL para siembra.
8. Después de que la solución de siembra haya equilibrado a 42-45 °C durante 10-15 min, transfiera 30 mL de la solución de siembra a un tubo con la muestra adecuada; dispense inmediatamente la mezcla de siembra y la muestra en una placa etiquetada. Repita con una pipeta nueva para cada muestra a sembrar.
9. Deje que las placas solidifiquen durante 15-20 min y luego colóquelas en una incubadora a 33 °C con 5% de CO₂. No invierta las placas durante al menos 48 h después de su preparación.
10. Dependiendo del fondo genético del clon receptor, verifique que las colonias aparezcan dentro de la agarosa en las placas de selección tras 10-21 días de incubación. Seleccione al menos 5-10 colonias que crezcan en la placa en presencia de ambos antibióticos utilizando una pipeta de borosilicato esterilizada de 5,75 pulgadas con tapón de algodón y siémbrelas en 1,5 mL de BSK 1x con el (los) antibiótico(s) adecuado(s).
11. Cultive las colonias inoculadas a 33 °C durante 3-5 días o hasta que alcancen una densidad de aproximadamente 20-40 espiroquetas por campo a 200x de aumento utilizando microscopía de campo oscuro.
    NOTA: Una vez seleccionadas, los espiroquetas pueden congelarse para almacenamiento a largo plazo a −80 °C mezclando un volumen igual de cultivo con una mezcla de 60% de glicerol y 40% de BSK 1x esterilizado por filtración a través de un filtro de 0,22 µm.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos cónicos para centrífuga de 15 mL (polipropileno)	USA Scientific	5618-8271
Mitomicina C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	PRECAUCIÓN: posible carcinógeno; usar únicamente en una campana extractora de gases químicos
Pipetas Pasteur de 5,75" (con tapón de algodón/vidrio borosilicato/no estériles)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	Esterilizar en autoclave antes de usar
Tubos cónicos para centrífuga de 50 mL (polipropileno)	USA Scientific	1500-1211
Etileno absoluto
Eritromicina	Research Products International Corp	E57000-25.0
Solución reactiva de gentamicina	Gibco	15750-060
Glucosa (dextrosa anhidra)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Sulfato de kanamicina	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0