Transferencia de genes a organoides intestinales de ratón mediante vectores lentivirales

Resumen

Fuente: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. Protocolo para la transducción lentiviral y análisis posterior de organoides intestinales. J. Vis. Exp. (2015)

Este video describe la transducción lentiviral de organoides intestinales de ratón a partir de una estructura similar a un cripto que contiene suspensión. Utilizando una matriz de membrana basal como andamiaje y medios suplementados con factores de crecimiento, se introducen vectores lentivirales para permitir la integración estable del gen

Protocolo

Transducción lentiviral de organoides

Día 0:

1. Divida un pocillo completo de 0,95 cm² de organoides dos días antes de la transducción en un nuevo pocillo, con el objetivo de obtener aproximadamente 50 organoides pequeños. Divida los organoides (Figura 1A, B).
2. Suplemente el medio de cultivo de organoides con 10 µM de Chir99021 y 10 mM de nicotinamida para obtener criptas hiperproliferativas quísticas (Figura 1C).
   NOTA: Las criptas quísticas se desarrollarán mejor cuando los organoides recién divididos se cultiven en presencia de Chir99021.

Día 2:

3. Recoger los organoides pipeteando hacia arriba y hacia abajo la mezcla de matrigel y medio, interrumpiendo así la mezcla con una micropipeta p1000. Coloque la mezcla en un tubo de 15 mL.
4. Disrupción adicional utilizando una pipeta de Pasteur cuya abertura distal se ha reducido mediante fusión. Centrifugar los organoides para formar un precipitado durante 5 min a 100 x g.
   NOTA: Dependiendo del tamaño de la centrífuga, utilice una velocidad diferente. Es necesario encontrar la velocidad exacta a la que los organoides disruptados se separan de la mezcla.
5. Elimine el sobrenadante y añada 500 µL de tripsina 1x precalentada (similar a tripsina al 0,25 %). Re-suspenda los organoides en tripsina e incube durante 3 min en un baño de agua a 37 °C.
6. Inactive la tripsina añadiendo 3,5 mL de medio de cultivo para líneas celulares [Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (FCS), 1 % de penicilina/estreptomicina y glutamina]. Centrifugue durante 5 min a 500 x g.
7. Elimine el sobrenadante dejando un precipitado en aproximadamente 20 µL de medio. Transfiera los organoides en esta pequeña cantidad residual de medio a un pocillo de una placa de 48 pocillos.
8. Añada lentivirus de alto título en medio de transducción, re-suspenda y continúe al paso 3.10. Cuando se encuentre baja eficacia de transducción.
   NOTA: Para una transducción eficiente, generalmente se añade una alícuota de 250 µL de lentivirus de alto título a un pocillo de organoides. Esto representa el 50 % de todo el lentivirus recolectado de una sola producción.
9. Opcional: para mejorar la eficacia de transducción, realice una spinoculación colocando la placa de 48 pocillos que contiene los organoides en una centrífuga precalentada a 32 °C y gire a 600 x g durante 1 h.
10. Coloque la mezcla de organoides y virus en una incubadora de cultivo e incube durante 1 h a 37 °C en la incubadora de cultivo para permitir la transducción.
11. Opcional: para mejorar aún más la eficacia de transducción, incube los organoides durante 3 h adicionales a 37 °C en una incubadora de cultivo.
12. Añada 1 mL de medio de cultivo de organoides y re-suspenda la mezcla de organoides y virus, transfiera a un tubo de microcentrífuga y centrifugue en una microcentrífuga durante 5 min a 850 x g para obtener un precipitado de organoides.
13. Elimine el sobrenadante y re-suspenda el precipitado en 20 µL de Matrigel frío. Dado que el material se solidifica al calentarse, utilice puntas de pipeta enfriadas pipeteando varias veces PBS frío.
14. Coloque la gota en el centro de un pocillo de una placa de 48 pocillos e incube en una incubadora de cultivo a 37 °C durante 15 min para solidificar.
15. Tras 15 min, añada cuidadosamente 250 µL de medio de cultivo de organoides suplementado con 10 mM de nicotinamida, 10 µM de Chir99021 y 10 µM de Y27632. Fragmentos pequeños de organoides disruptados formarán organoides quísticos pequeños en un plazo de 24 h.

Día 5:

16. Renueve el medio y suplemente con una selección de antibióticos (para puromicina, use 4 µg/mL).

Día 7:

1. Reemplace el medio con medio de cultivo estándar de organoides, suplementado con antibiótico de selección.
   NOTA: La formación de brotes se completará entre 2 y 3 semanas después de la retirada de Chir99021. Después de la selección, los organoides pueden crecer sin antibióticos de selección.

Resultados

Figura 1: Esquema de la producción de lentivirus para la transducción de organoides.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Polietileno imina	Polysciences	23966-2
Medio DMEM	Lonza	BE12-614F
Suero bovino fetal	Lonza	DE14-801F
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen	15140-122
Glutamina	Invitrogen	25030-024
Matrigel	BD	BD 356231
DMEM-F12 avanzado	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetil cisteína	Sigma	A9165-1G
EGF de ratón	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
Glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
Polybrene	Sigma	107689
Nicotinamida	Sigma	N0636
Tripsina	Lonza	BE02-007E