Detección de la activación de la vía SMAD mediante transducción con adenovirus dual

Resumen

Fuente: Chen, H., et al. Imagen de Células Vivas de la Vía de Señalización TGF-β/Smad3 In Vitro e In Vivo Mediante un Sistema de Reportero con Adenovirus. J. Vis. Exp. (2018).

Este video demuestra un método para estudiar la activación de la vía SMAD en células de cáncer de mama mediante infección dual con adenovirus. Un virus entrega un gen GFP expresado constitutivamente, mientras que el otro lleva un reportero RFP bajo un promotor sensible a SMAD. Tras la estimulación con TGF-beta, las proteínas SMAD se activan, formando un complejo que induce la expresión de RFP. La detección de señales duales en células vivas confirma la activación de la vía.

Protocolo

1. Transducción con doble adenovirus en células individuales vivas

1. Siembre 1,0 - 1,5 x 10⁵ células MDA-MB-231 con 500 μL de medio de cultivo DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) que contenga 5 % de suero bovino fetal (FBS) en cada pocillo de una placa de 12 pocillos (confluencia celular del 35 %, 2 pocillos en total).
2. Infecte las células con 75 μL del vector adenoviral Ad-CMV-GFP (titulación = 5 x 10⁹ PFU/mL) y 7,5 μL del vector adenoviral Ad-CAGA12-Td-Tom (titulación = 5 x 10¹⁰ PFU/mL) para obtener una multiplicidad de infección (MOI) de 2.500, lo que puede lograr una positividad del 100 % en la infección.
3. Trate las células con o sin 0,25 μL de factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) por pocillo (10 mg/mL en stock, 5 ng/μL como concentración final) inmediatamente después de la infección con adenovirus.
4. Coloque la placa en el incubador a 37 °C con 10 % de CO₂ durante 24 h.
5. Obtenga imágenes de células vivas mediante un microscopio de fluorescencia de contraste de fase. Excite la proteína verde fluorescente (GFP) a 470 nm y la proteína Td-Tomato a 554 nm.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	ThermoFisher	1881024	Calentar en baño de agua a 37 °C antes de usarlo
Suero Bovino Fetal	Scientifix Life	FBS500-S	Inactivar por calor antes de usarlo
TGF-β1 Humano Recombinante	PEPROTECH	100-21	Aliquotear en agua destilada para obtener una concentración final de 10 mg/mL
Microscopía de fluorescencia de contraste de fase	OLYMPUS	IX50
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
Solución			Composición
FBS-DMEM			5% FBS inactivado por calor; 10 μg/mL de penicilina; 100 μg/mL de estreptomicina