Imágenes de fluorescencia multiplexadas de ácidos nucleicos virales y proteínas en linfocitos humanos infectados

Resumen

Fuente: Shah, R., et al. Imagen de fluorescencia multiplexada en célula individual para visualizar ácidos nucleicos y proteínas virales y monitorear la infección por VIH, HTLV, VHB, VHC, virus Zika e influenza. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra la visualización simultánea de ADN, ARN y proteína de cápside del VIH-1 en linfocitos humanos infectados mediante hibridación de ADN ramificado e inmunofluorescencia, lo que permite un análisis detallado de las etapas de replicación viral dentro de células individuales.

Protocolo

1. Inmunomarcado de proteínas: Para etiquetar la(s) proteína(s) de interés

1. Decantar PBS (solución salina tamponada con fosfato) y añadir 200 µL de tampón bloqueante (1% p/v BSA (albúmina sérica bovina), 10% v/v FBS (suero bovino fetal) en PBS con 0,1% v/v Tween-20 (PBST) sobre la laminilla. Incubar 1 h a RT (temperatura ambiente).
2. Decantar el tampón bloqueante y aplicar 200 µL de anticuerpo primario diluido en PBST + 1% p/v BSA. Incubar 1 h a RT.
3. Lavar la preparación dos veces con PBST durante 10 min a RT con agitación.
4. Aplicar un anticuerpo secundario de elección durante 1 h a RT en PBST + 1% p/v BSA.
5. Lavar la preparación con PBST durante 10 min a RT con agitación.

2. Tinción nuclear: Contratinción de núcleos tras la inmunotinción

1. Decante el PBST y añada DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) o tinción nuclear de elección durante 1 min a temperatura ambiente (RT).
2. Lave el portaobjetos dos veces con PBS durante 10 min a temperatura ambiente (RT) con agitación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo anti-NS5a del VHC	Abcam	ab13833	Monoclonal de ratón; funciona con los genotipos 1a, 1b, 3 y 4 del VHC
Anticuerpo monoclonal anti-p24 del VIH-1	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anticuerpo anti-Mov10	Abcam	ab80613	Policlonal de conejo
Albúmina sérica bovina			Reactivo bloqueante para inmunotinción
Medio celular con suplementos			Medio adecuado para el modelo celular
Cubreobjetos
DAPI	ACD Bio		Tinción nuclear (kit RNAscope de ACD Bio)
Fosfato de tampón salino de Dulbecco (PBS 1X)	Gibco	14190250	Sin calcio ni magnesio
Suero bovino fetal (FBS)			Utilizar FBS específico según el suero en el que se produjo el anticuerpo secundario (por ejemplo, FBS de cabra)
Portaobjetos Fisherbrand Colorfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Precleaned
Portaobjetos
Tween-20			Para tampón de hibridación de ADN y PBS-T