Purificación de intasomas del virus espumoso prototipo mediante cromatografía de exclusión molecular

Resumen

Fuente: Mackler, R. M., et al. Ensamblaje y Purificación de Intasomas de Virus Espumosos Prototípicos. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra la purificación de intasomas del virus espumoso prototípico (PFV) a partir de una suspensión mixta de proteína-ADN mediante extracción con sal y cromatografía de exclusión por tamaño, obteniendo complejos activos para análisis posteriores.

Protocolo

1. Solubilización del intasoma

1. Prepare dos puntas de pipeta de gran orificio eliminando 2-4 mm del extremo de una punta de 200 µL con una cuchilla de afeitar o bisturí nueva sobre una superficie limpia.
   NOTA: Las puntas se utilizarán en los pasos 1.3 y 1.5.
2. Retire el tubo de diálisis del tampón de diálisis. Para evitar la dilución de la muestra de intasoma con tampón de diálisis que pueda quedar en el extremo del tubo cerca del clip, use una micropipeta con una punta pequeña para eliminar cualquier exceso de tampón de diálisis. Retire el clip de un extremo del tubo de diálisis.
3. Use una punta de pipeta de gran orificio del paso 1.1 para transferir la muestra, incluyendo el precipitado dentro del tubo de diálisis, a un tubo de 1,5 mL sobre hielo. 
   NOTA: El volumen total del material recuperado es típicamente de ~140 µL.
4. La muestra con precipitado está a 200 mM NaCl; aumente la concentración de sal hasta una concentración final de 320 mM NaCl añadiendo el volumen apropiado de una solución stock de NaCl 5 M. Por ejemplo, para una muestra de 150 µL, añada 3,9 µL de NaCl 5 M y 1,1 µL de ddH₂O para obtener un volumen final de 155 µL. Transfiera el recipiente con hielo y la muestra a una cámara fría a 4 ˚C.
5. Use una punta de pipeta de gran orificio del paso 1.1 para resuspender y solubilizar el precipitado mediante pipeteo. Repita cada 20 minutos durante al menos 1 hora. Observe que la mayor parte del precipitado debería disolverse.
   NOTA: El pipeteo para resuspender el precipitado puede detenerse cuando sea evidente que el precipitado ya no se reduce notablemente entre intervalos de tiempo. Cuando el ADN viral (vADN) no está marcado o está marcado internamente, el precipitado se reduce en ~90% según la inspección visual. En el caso del vADN marcado en el extremo con Cy5, el precipitado se reduce solo en ~20%; la mayor parte del precipitado con vADN marcado en el extremo con fluoróforo no se solubilizará. La cantidad de precipitado que se solubiliza efectivamente es variable y debe determinarse empíricamente.

2. Purificación del intasoma

1. Prepare 250 mL de tampón de funcionamiento para cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (20 mM Bis-tris propano, pH 7,5, 320 mM NaCl, 10 % de glicerol). Filtre estérilmente el tampón mediante una unidad de filtro de 0,2 µm y almacénelo a 4 ˚C.
   NOTA: Todos los pasos de purificación se realizan en una cámara fría a 4 ˚C.
2. Equilibre una columna SEC de agarosa reticulada (diámetro = 10 mm; longitud = 300 mm; volumen de lecho = 24 mL; volumen de muestra = 25 - 500 µL; presión máxima = 1,5 MPa; límite de exclusión = 4 x 10⁷ Da; separa pesos moleculares entre 5 y 5.000 kDa, véase la Tabla de Materiales) con el tampón de funcionamiento SEC a un caudal de 0,4 mL/min.
   NOTA: Esta purificación puede adaptarse a diferentes columnas de exclusión por tamaño si son capaces de separar eficazmente 300 kDa de 44 kDa, como Superose 12 10/300 GL o Superose 6 Increase. Superose 12 10/300 GL tiene una resolución más baja, lo que provoca un mayor solapamiento de picos. Por el contrario, Superose 6 Increase tiene una mayor resolución y ofrece una mejor separación.
3. Centrifugue la muestra de intasoma en una microcentrífuga a 14.000 x g durante 10 min a 4 ˚C para sedimentar cualquier precipitado restante. Retire cuidadosamente el sobrenadante. Cargue el sobrenadante en un bucle de inyección de 200 µL (tubo que puede contener ~200 μL). Aplique la muestra a la columna SEC.
   NOTA: Volúmenes de carga más pequeños permiten una mayor resolución mediante SEC.
4. Eluya con 25 mL de tampón de funcionamiento SEC y recoja 95 fracciones de 270 µL. Observe que el cromatograma SEC muestra tres picos de A₂₈₀/A₂₆₀ (Figura 1).
   NOTA: El primero debe corresponder a un agregado (~9,0 - 11,5 mL de elución), seguido por el pico del intasoma tetramérico de PFV (~12,0 - 14,75 mL de elución) y el pico del monómero de PFV IN con vDNA libre (~15,0 - 18,0 mL).

Resultados

Figura 1: Cromatograma de exclusión por tamaño. Un ensamblaje de intasoma de PFV se separó mediante una columna de SEC de agarosa. Esta columna permite la separación del agregado (1), el intasoma de PFV formado por un tetrámero de IN de PFV y dos vDNA (2), y la forma monomérica de IN de PFV junto con vDNA (3). En este ejemplo se incluyó vDNA con un marcado interno con el fluoróforo Cy5, detectado mediante excitación a 650 nm. El eje y denota la densidad óptica (DO) en unidades de milimilimabsorbancia (mAU).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Oligómeros de ADN	IDT	N/A	Oligos de ADN personalizados
NaCl	P212121	RP-S23020
BIS-TRIS propano, >=99,0 % (titulación)	Sigma-Aldrich	B6755-500G
Glicerol	Thermo Fisher Scientific	G37-20
Puntas para carga de geles, 1 - 200 μL	Corning	CLS4853-400EA
Cuchilla de afeitar; de borde único; 100/unidad; paquete de 100	Fisher Scientific	12-640
Clips para tubos de diálisis	Spectrum Labs	132734
Tubo de diálisis de 6-8 kDa, 10 mm	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201