Obtención de ARN viral para el análisis mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR)

Resumen

Fuente: Suzuki, Y., et al. Medición del ARN del virus del dengue en el sobrenadante de cultivo de células infectadas mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real. J. Vis. Exp. (2018).

Este video demuestra el procedimiento para preparar muestras virales para el análisis mediante PCR cuantitativa (reacción en cadena de la polimerasa). Las muestras virales y los patrones de ARN se diluyen seriamente, se tratan con un tampón de proteinasa K y se incuban a temperaturas controladas para liberar el ARN. El ARN procesado luego se estabiliza y almacena para la cuantificación de los niveles de ARN viral.

Protocolo

1. Procesamiento de muestras de virus para RT-qPCR (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real)

NOTA: Los pasos 1.1–1.3 deben realizarse dentro de una cabina de seguridad biológica. En particular, el manejo del sobrenadante de cultivo que contiene un virus infeccioso debe realizarse en un entorno de nivel de seguridad biológica 2 (o superior).

1. Mezcle 199 μL de un tampón de procesamiento y 1 μL de proteinasa K libre de nucleasas.
2. Diluya en serie el ARN sintetizado de la región 3’UTR (región no traducida) del virus del dengue (DENV) en una proporción de 1:10 para obtener un estándar de ARN de 5 x 10⁹ a 5 x 10³ copias/μL, utilizando medio de cultivo celular (por ejemplo, DMEM [medio de Eagle modificado por Dulbecco] suplementado con 10 % de suero bovino fetal y antibióticos [DMEM/10 % suero bovino fetal]) que contenga 40 unidades/mL de inhibidor de RNasa.
3. Mezcle 5 μL del sobrenadante del cultivo de células infectadas con DENV y el estándar de ARN de la región 3’UTR del DENV con 5 μL de la solución de tampón de procesamiento/proteinasa K, utilizando tiras de PCR de 8 tubos o una placa de PCR de 96 pocillos. Como control sin molde (NTC), mezcle 5 μL de medio de cultivo celular (es decir, sin virus) con 5 μL de la solución de tampón de procesamiento/proteinasa K.
4. Tras una breve centrifugación, incube las muestras en un termociclador utilizando las siguientes condiciones: 1 ciclo (a 25 °C durante 10 min y a 75 °C durante 5 min).
NOTA: Las muestras procesadas pueden mantenerse a 4 °C si el análisis de PCR en tiempo real se realiza el mismo día. Para almacenamiento a largo plazo, las muestras deben conservarse a -80 °C.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ciclador térmico SimpliAmp	Thermo Fisher Scientific	A24811	Instrumento térmico comparable, pero las condiciones del ciclo de PCR deben optimizarse.
Inhibidor de RNasa recombinante	Takara Bio. Inc	2313A	40 unidades/μL
Kit RNeasy Mini	Qiagen	74104	Puede utilizarse un kit comparable de purificación de ARN.
Proteasa K	Nacalai Tesque	15679-06	>600 unidades/mL. Puede utilizarse un reactivo comparable.
Placa de reacción MicroAmp Fast Optical de 96 pozos, 0,1 mL	Thermo Fisher Scientific	4346907	Puede utilizarse una placa o tubo comparable según el instrumento de PCR en tiempo real, pero las condiciones del ciclo de PCR deben optimizarse.