Recolección de partículas del virus de la hepatitis E a partir de células de cáncer hepático humano

Resumen

Fuente: Meister, T. L., et al. Un modelo de cultivo celular para producir partículas del virus de la hepatitis E con alto título. J. Vis. Exp. (2020).

Este video demuestra el proceso de aislamiento de partículas del virus de la hepatitis E (HEV) a partir de células de carcinoma hepatocelular humano transfectadas. Las partículas virales extracelulares se recogen de sobrenadantes filtrados, mientras que las partículas intracelulares se liberan sometiendo las células a ciclos repetidos de congelación-descongelación. El lisado se centrifuga, y el sobrenadante que contiene partículas de HEV se alícuota y almacena a una temperatura ultra baja para su uso futuro.

Protocolo

1. Preparación de células HepG2 para la producción de virus de la hepatitis E derivado de cultivo celular (HEVcc)
NOTA: Para evitar contaminación, la preparación de células, electroforesis, infección, recolección y fijación celular se realizaron bajo condiciones estériles en una instalación de nivel de bioseguridad 2. Los pasos de incubación a 37 °C que involucraban células se llevaron a cabo en un incubador con 5 % de CO₂.

1. Para preparar las células HepG2 para la producción de HEVcc (Figura 1), siembre las células en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) completo (consulte la Tabla 1) sobre un recipiente de cultivo de 15 cm recubierto con colágeno (consulte la Tabla 1; filtre estérilmente la mezcla de ácido acético en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a través de una malla de 0,2 µm antes de añadir el colágeno). Incube a 37 °C hasta que las células alcancen una confluencia del 90%.
   NOTA: Cada placa de 15 cm que contenga células con una confluencia del 90 % generará suficientes células para hasta 4 electro poraciones.
2. Retire suavemente el medio de la placa y lave las células una vez con 10 mL de PBS 1x. Tripsinice las células añadiendo 3 mL de tripsina-EDTA al 0,05 % sobre las células e incube a 37 °C hasta que se desprendan completamente. Re suspenda las células en 10 mL de medio DMEM completo y transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mL. Determine el número total de células.
3. Dado que cada electro poración requiere 5 x 10⁶ células, transfiera el volumen adecuado a un nuevo tubo de 50 mL y complete hasta al menos 35 mL con PBS 1x. Centrifugue las células a 200 x g durante 5 min y deseche cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular.
4. Lave las células una vez más con 35 mL de PBS 1x a 200 x g durante 5 min. Coloque las células en hielo y aún no retire el PBS 1x, para mantener las células en suspensión.

2. Electrotransferencia de células HepG2

1. Para la electrotransferencia de células HepG2 (Figura 2), prepare 400 µL de Cytomix completo por electrotransferencia suplementando 384 µL de Cytomix (véase Tabla 1) con ATP 2 mM y glutatión 5 mM. Prepárelo fresco justo antes de usarlo y colóquelo inmediatamente en hielo.
   NOTA: Es fundamental ejecutar correctamente y con rapidez los siguientes pasos. Por lo tanto, asegúrese de que todo esté preparado adecuadamente.
2. Retire cuidadosamente el PBS 1x sin perturbar el sedimento celular del paso 4.4. Re suspenda 5 x 10⁶ células en 400 µL de Cytomix completo y añada 5 µg de ARN. Transfiera la solución a una cubeta de 4 mm y aplique un pulso de 975 µF, 270 V durante 20 ms con un sistema de electrotransferencia.
   1. Tras la electrotransferencia, transfiera las células lo más rápidamente posible con una pipeta Pasteur a 11 mL de DMEM completo por cada electrotransferencia.
      NOTA: Para asegurar que el ARN se ha transfectado con éxito en las células HepG2, se realizará un control de transfección (TC). Se esperan tasas de transfección entre el 40 y el 60 % de células positivas para ORF2.
3. Transfiera 10 mL de células electrotransferidas a una placa de cultivo de 10 cm recubierta con colágeno. Añada 1,3 x 10⁵ células electrotransferidas (300 µL) a un pocillo de una placa de 24 pocillos recubierta con colágeno que contenga una laminilla (que posteriormente se usará como control de transfección). Distribuya las células uniformemente e incube a 37 °C.
   1. Tras 24 h, cambie el medio en la placa de 10 cm y reemplácelo con 10 mL de DMEM completo fresco. No cambie el medio del control de transfección. Incube durante otros 6 días a 37 °C.

3. Recolección de partículas de virus de la hepatitis E derivadas de cultivos celulares intra- y extracelulares (HEVcc)

1. Para cosechar el HEVcc extracelular (Figura 3), filtre el sobrenadante obtenido del plato de 10 cm después de 6 días a través de una malla de 0,45 µm para eliminar cualquier resto celular. Almacene el HEVcc extracelular cosechado a 4 °C para su uso en infecciones el mismo día; de lo contrario, almacénelo a -80 °C.
2. Para cosechar el HEVcc intracelular (Figura 3), lave las células con PBS 1x y realice una tripsinización añadiendo 1,5 mL de tripsina-etilendiaminotetraacético (tripsina-EDTA) al 0,05 %. Incube a 37 °C hasta que las células se desprendan completamente. Añada 10 mL de DMEM completo, enjuague la placa para desprender las células y transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mL. Lave las células dos veces con PBS. Centrifugue a 200 x g durante 5 min.
   1. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 1,6 mL de DMEM completo por electro poración. Transfiera la suspensión celular a un tubo de reacción de 2 mL.
      NOTA: No utilice volúmenes mayores, ya que disminuiría drásticamente la carga viral.
   2. Congele (en nitrógeno líquido) y descongele las células. Repita este ciclo 3 veces.
      NOTA: No agrupe más de una electro poración (1,6 mL) para los 3 ciclos de congelación-descongelación, ya que la eficiencia de lisis se vería afectada. No vortexe la suspensión celular entre los ciclos. Asegúrese de descongelar lentamente la suspensión celular (por ejemplo, a temperatura ambiente o sobre hielo) para maximizar la carga viral.
   3. Someta las células lisadas a centrifugación de alta velocidad durante 10 min a 10.000 x g para separar los restos celulares. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Utilice el sobrenadante para la infección; de lo contrario, almacénelo a -80 °C.
   4. Opcionalmente, concentre el HEVcc extracelular e intracelular utilizando un concentrador para aumentar la carga viral.

Tabla 1: Tabla de composición de los tampones.

Solución de trabajo	Concentración	Volumen
Colágeno	40 mL	PBS
	40 µl	Ácido acético
	1 mL	Solución de colágeno R estéril al 0,4%
Cytomix	120 mM	KCl
	0,15 mM	CaCl2
	10 mM	K2HPO4 (pH 7,4)
	25 mM	HEPES
	2 mM	EGTA
DMEM completo	500 mL	DMEM
	5 mL	Pen/Strep
	5 mL	MEM NEAA (100X)
	5 mL	L-Glutamina
	50 mL	Suero bovino fetal
MEM completo	500 mL	MEM
	5 mL	Piruvato de sodio
	5 mL	Gentamicina
	5 mL	MEM NEAA (100X)
	5 mL	L-Glutamina
	50 mL	ultra-low IgG

Resultados

Figura 1: Configuración experimental esquemática para la preparación de células HepG2 para la producción de virus de la hepatitis E derivado de cultivo celular (HEVcc).

Figura 2: Configuración experimental esquemática para la electroforesis de células HepG2.

Figura 3: Configuración experimental esquemática para la recolección de HEVcc intra- y extracelular.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Malla de 0,45 µm	Sarstedt	83.1826	Recolección de virus extracelular
MEM	gibco	31095-029	Cultivo celular
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Cultivo celular
Tripsina-EDTA (0,5 %)	gibco	15400054	Cultivo celular
Inmunoglobulina G ultra baja	gibco	1921005PJ	Cultivo celular
Ácido acético	CarlRoth	6755.1	Solución de colágeno de trabajo
ATP	Roche	11140965001	Transcripción in vitro y electroforesis
BioRender	BioRender		Generación de figuras
Cloruro de calcio	Roth	5239.2	Cytomix
Solución de colágeno R estéril al 0,4 %	Serva	47256.01	Solución de colágeno de trabajo
DMEM	gibco	41965-039	Cultivo celular
EGTA	Roth	3054.3	Cytomix
Sistema de electroforesis GenePulser Xcell	BioRad	1652660	Electroporación
HEPES	Invitrogen	15630-03	Cytomix
Fosfato de di-potasio	Roth	P749.1	Cytomix
KCL	Roth	6781.3	Cytomix
Fosfato de potasio dihidrógeno	Roth	3904.2	Cytomix
L-Glutamina	gibco	25030081	Cultivo celular
Glutatión reducido di-potásico	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Cytomix
MEM	gibco	31095-029	Cultivo celular
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Cultivo celular
Cloruro de magnesio	Roth	2189.2	Cytomix
Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	Concentración de ADN/ARN
PBS	gibco	70011051	Cultivo celular
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Cultivo celular