Purificación del virus a partir del líquido alantoideo de huevos de gallina embrionados

Resumen

Fuente: Yates, J. G. E., et al. Producción de virus recombinante de la enfermedad de Newcastle de alto título a partir de líquido alantoideo. J. Vis. Exp. (2022)

El video demuestra la purificación y concentración de partículas virales a partir de líquido alantoideo clarificado obtenido de huevos de gallina embrionados infectados con virus. Se muestra una serie de pasos de filtración y separación, incluyendo filtración de profundidad, filtración de flujo tangencial y ultracentrifugación en gradiente de densidad para aislar virus intactos. La fracción rica en virus se dializa luego para eliminar sales residuales y componentes del gradiente mediante difusión, seguida de concentración utilizando una solución hipertónica a través de ósmosis. El resultado es una preparación de virus purificada y de alto título, adecuada para uso experimental.

Protocolo

1. Amplificación del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) utilizando huevos de gallina embrionados libres de patógenos específicos

1. Inoculación de huevos de gallina embrionados libres de patógenos específicos (SPF)
   NOTA: Por lo general, se utilizan ocho docenas de huevos de gallina embrionados SPF para generar un lote de virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) de grado in vivo. Encargue una o dos docenas adicionales de huevos para compensar posibles daños durante el transporte, así como la variabilidad en viabilidad.
   1. Tras recibir los huevos de gallina embrionados SPF, incúbelos en una incubadora de huevos a 37 °C y 60 % de humedad durante 9 días. Asegúrese de que la incubadora esté configurada para mover o rotar automáticamente los huevos cada hora.
      NOTA: Los huevos pueden almacenarse a temperatura ambiente hasta 24 h o a 4 °C hasta 72 h; sin embargo, esto podría disminuir la viabilidad del embrión.
   2. Después de 8-11 días de incubación (idealmente el día 9), realice la candela de los huevos para determinar la viabilidad del embrión. Busque una vascularización en forma de red (Figura 1A) y movimiento del embrión como indicadores de embriones viables. Deseche los huevos que carezcan de estas características (Figura 1B).
   3. En los huevos viables, marque con un lápiz una 'X' en la interfase entre el saco aéreo y el embrión (Figura 1A). Asegúrese de que este sitio de inyección no provoque la perforación de la vascularización. Devuelva los huevos marcados a la incubadora mientras se prepara el inóculo.
   4. Calcule la cantidad de virus necesaria para inyectar todos los huevos de gallina embrionados SPF. Asegúrese de que cada huevo reciba 100 unidades formadoras de placas (PFU) de virus en un volumen de 100 µL; diluya el virus en solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta una concentración de 1 × 10³ PFU/mL. Prepare un 20 % adicional del inóculo para compensar posibles inexactitudes en la administración del virus.
   5. Utilice una toallita antiestática para limpiar la parte superior de los huevos marcados con una solución de yodo al 10 % diluida en etanol al 70 %. Espere aproximadamente 1-2 minutos para que la solución se seque.
   6. Perfore cuidadosamente la cáscara con un par de pinzas estériles y afiladas. Sane las pinzas con etanol al 70 % entre cada huevo.
   7. Utilizando una jeringa de 1 mL y una aguja de 25 G, inyecte 100 µL del inóculo preparado en el paso 1.1.4 en la cavidad corioalantoidea (Figura 1C). Inserte la aguja en un ángulo cercano a los 90° respecto al huevo. Introduzca la aguja justo en la parte superior de la membrana corioalantoidea.
   8. Tras la inoculación, use esmalte de uñas para cubrir el sitio de punción y devuelva los huevos a la incubadora. Asegúrese de que la función de balanceo esté activada hasta 24 h posteriores a la inoculación.
   9. Verifique la viabilidad de los huevos 24 h después de la inoculación. Descarte los huevos muertos que carezcan de vascularización en la membrana corioalantoidea y movimiento del embrión (Figura 1B).
      NOTA: Estos huevos murieron debido al proceso de inoculación y no por el NDV.
   10. Devuelva los huevos a la incubadora, con la función de balanceo DESACTIVADA para evitar la contaminación del líquido alantoideo con proteínas del huevo.
   11. Revise los huevos cada 12-24 h según se describe en el paso 1.1.9 para identificar huevos muertos. Coloque los huevos que mueran después de las 24 h posteriores a la inoculación a 4 °C para minimizar la autólisis. Recolecte el líquido alantoideo entre 2-12 h después del enfriamiento.
   12. Incube los huevos durante al menos 72 h.
       NOTA: Si se está propagando una cepa mesogénica de NDV, el tiempo óptimo de incubación es de 60-72 h, ya que tiempos de incubación prolongados pueden dificultar el proceso de purificación debido a la menor claridad del líquido alantoideo. Este problema no es tan relevante al propagar cepas lentogénicas de NDV, ya que tardan mucho más en matar al embrión.
   13. Tras el periodo adecuado de incubación, traslade los huevos restantes a 4 °C durante 2-12 h antes de recolectar el líquido alantoideo.
2. Recolección del líquido alantoideo que contiene NDV
   1. Traslade los huevos enfriados a la cabina de seguridad biológica. Limpie la parte superior de los huevos con etanol al 70 %.
   2. Utilice pinzas estériles y tijeras quirúrgicas para romper el lado apical del huevo donde se encuentra el saco aéreo.
   3. Retire la cáscara para exponer la membrana corioalantoidea (Figura 1D).
   4. Perfore cuidadosamente la membrana y levántela para exponer la cavidad alantoidea (Figura 1E). Asegúrese de no perforar accidentalmente el saco de la yema, ya que esto echaría a perder el huevo.
   5. Utilice pinzas romas para agarrar el embrión y abrir el saco embrionario.
      NOTA: El líquido dentro del saco embrionario también contiene NDV.
   6. Presione el embrión con las pinzas y recoja el líquido alantoideo utilizando una pipeta serológica de 10 mL.
   7. Almacene el líquido alantoideo sobre hielo en tubos cónicos de 15 mL hasta su clarificación.
      NOTA: Si el líquido alantoideo es amarillo, significa que el saco de la yema ha sido comprometido y el líquido alantoideo debe desecharse.
   8. Centrifugue los tubos cónicos que contienen el líquido alantoideo a 1.500 × g durante 10 min a 4 °C.
   9. Punto de pausa: Aliquote el líquido alantoideo clarificado en tubos cónicos de 50 mL y almacénelos a -80 °C para conservación a largo plazo (por ejemplo, semanas o meses), suplementando el líquido con sacarosa hasta una concentración final del 5 % para proteger al virus de los efectos adversos de los ciclos de congelación-descongelación. Alternativamente, para almacenamiento a corto plazo (por ejemplo, 1-3 días), suplemente el líquido alantoideo con sacarosa (5 % final) o con tampón Mannitol-Lisina (ML) 3× (15 % Mannitol, 3 % Lisina) para obtener una concentración final de 1× (5 % Mannitol, 1 % Lisina) antes de almacenar a 4 °C.

2. Purificación del VND a partir del líquido alantoideo

1. Filtración por profundidad del líquido alantoideo
   1. Almacene el líquido alantoideo clarificado a -80 °C y descongélelo a 4 °C la noche anterior a la purificación.
   2. En una cabina de seguridad biológica, prepare el tubo y la bomba peristáltica como se muestra en Figura 2.
   3. Si aún no se ha realizado, combine el líquido alantoideo con tampón ML 3× hasta alcanzar una concentración final de 1×.
   4. Antes de conectar el filtro por profundidad, esterilice el tubo haciendo pasar 50 mL de hidróxido de sodio (NaOH) 0,5 M a través del sistema hacia un recipiente de desecho.
   5. Lave el tubo haciendo pasar 100 mL de agua estéril de grado molecular a través del sistema y hacia el recipiente de desecho.
      NOTA: Dado que el NaOH inactivará el VND, es importante lavar adecuadamente las líneas antes de introducir el líquido alantoideo que contiene el virus.
   6. Prepare el sistema haciendo pasar 50 mL de PBS a través de él, deteniendo la bomba cuando queden aproximadamente 5 mL de PBS en el tubo.
   7. Conecte un filtro por profundidad con una capacidad de retención de 1-3 µM al tubo y retire la segunda tapa del lado apical del filtro para ventilarlo. Comience a hacer pasar otros 50 mL de PBS a través del sistema.
   8. Una vez que el PBS comience a fluir por la salida de ventilación en la parte superior del filtro, cierre el puerto y continúe haciendo pasar PBS a través de las líneas.
      NOTA: Son aceptables pequeñas burbujas de aire, pero si hay grandes cantidades de aire, será necesario ventilar nuevamente el filtro como se describe en los pasos 2.1.7 y 2.1.8.
   9. Detenga la bomba cuando queden aproximadamente 5 mL de PBS en el tubo.
   10. Reemplace el recipiente de desecho por un nuevo recipiente estéril de recolección y comience a hacer pasar el líquido alantoideo a través del filtro por profundidad.
       NOTA: La presión no debe exceder 10 psi, ya que esto provocaría la ruptura del virus. La presión puede ajustarse disminuyendo o aumentando el caudal de la bomba. Si la presión comienza a superar los 10 psi y el caudal no puede reducirse más, debe usarse un nuevo filtro por profundidad. En este caso, deben realizarse los pasos 2.1.6-2.1.8 antes de reanudar el flujo del líquido alantoideo.
   11. Una vez que todo el líquido alantoideo haya pasado a través del filtro, haga pasar 50 mL de tampón ML 1× a través de las líneas para maximizar la recuperación del virus.
   12. Recoja el líquido hasta que las líneas queden secas. Almacene el virus durante la noche o hasta 36 h a 4 °C.
       NOTA: Una vez que el virus haya sido filtrado por profundidad, continúe el proceso de purificación dentro de las 36 h posteriores a la finalización de la filtración por profundidad.
   13. Desconecte el filtro por profundidad y sane el tubo haciendo pasar 100 mL de NaOH 0,5 M y lejía al 400 partes por millón (ppm) precalentada a 42 °C a través del sistema antes de almacenarlo en NaOH 0,5 M.
2. Filtración tangencial para la concentración del VND
   1. Monte los componentes del cartucho como se muestra en Figura 3A dentro de una cabina de seguridad biológica.
      NOTA: La placa distribuidora y la placa final deben lavarse con detergente y secarse antes de su uso. Las juntas de silicona son reutilizables y deben almacenarse en NaOH 0,5 M junto con el cartucho.
   2. Configure el sistema de filtración tangencial (TFF) (también conocido como filtración de flujo cruzado) en una conformación "abierta" (Figura 3B).
      1. Si se utiliza el cartucho por primera vez, ensamble el cartucho TFF en la conformación de elución y enjuáguelo con 100 mL de agua estéril de grado molecular (Figura 3C).
      2. Una vez que queden solo 5 mL de agua en el tanque del depósito, detenga la bomba y cambie la configuración del sistema TFF a una conformación cerrada (Figura 3D).
      3. Agregue 100 mL de NaOH 0,5 M y lejía al 400 ppm precalentada a 42 °C al depósito y haga circular la solución durante 30-60 min.
      4. Detenga el flujo y devuelva el sistema TFF a la configuración de elución, reanudando el flujo para eliminar la solución de limpieza.
      5. Cuando queden aproximadamente 5 mL en el depósito, detenga la bomba y agregue 100 mL de agua estéril de grado molecular para enjuagar el sistema.
      6. Cuando queden aproximadamente 5 mL en el depósito, detenga la bomba y coloque el sistema TFF en la conformación abierta (Figura 3B). Continúe con el paso 2.2.3.
   3. Esterilice el cartucho y el tubo haciendo pasar 100 mL de NaOH 0,5 M a través del sistema utilizando la bomba peristáltica. Asegúrese de que la presión no supere los 30 psi para mantener la integridad del cartucho.
   4. Detenga la bomba cuando queden aproximadamente 5 mL de NaOH 0,5 M en el depósito.
   5. Agregue 100 mL de agua estéril de grado molecular al depósito y reanude el paso del fluido a través del cartucho. Agite el depósito para lavar todo el NaOH de las paredes y evitar la inactivación del virus. Repita el paso de enjuague del depósito.
   6. Cuando queden aproximadamente 5 mL de agua estéril de grado molecular en el depósito, detenga la bomba.
   7. Agregue 100 mL de PBS al depósito, agitando para asegurarse de que el agua estéril de grado molecular se haya eliminado de las paredes. Reanude el flujo de líquido a través del cartucho.
   8. Cuando queden aproximadamente 5 mL en el depósito, detenga la bomba, agregue el líquido alantoideo filtrado por profundidad al depósito y reanude el flujo de la bomba.
   9. Monitoree el manómetro 1 (Figura 3B) para asegurarse de que no supere los 10 psi y así evitar la ruptura del virus. Combine la velocidad de la bomba peristáltica y el uso de abrazaderas en C para aumentar la elución hacia el desecho.
      NOTA: Combinar la velocidad de la bomba peristáltica y las abrazaderas en C aumentará la presión.
   10. Cuando queden 50-100 mL de líquido alantoideo en el depósito, detenga la bomba para realizar un intercambio de tampón agregando 150-200 mL de tampón ML 1×.
   11. Reanude el flujo de la bomba, monitoreando nuevamente el manómetro 1 (Figura 3B) para asegurarse de que no supere los 10 psi.
   12. Cuando queden 5-10 mL en el depósito, detenga la bomba.
   13. Utilizando dos abrazaderas en C, cierre las dos líneas de desecho como se muestra en Figura 3C.
   14. Desconecte la línea de retenido que alimenta el depósito e insértela en un tubo cónico de 50 mL (Figura 3C).
   15. Reanude el flujo de la bomba, deteniéndose cuando queden unas pocas gotas de líquido en el tanque del depósito.
   16. Retire las abrazaderas en C de las líneas de desecho y vuelva a conectar la línea de alimentación de retenido al tanque del depósito (Figura 3B).
   17. Agregue 20-25 mL de tampón ML 1× y reanude el flujo de la bomba hasta que queden aproximadamente 5 mL en el tanque del depósito.
   18. Repita los pasos 2.2.13 a 2.2.16.
       NOTA: Se puede realizar una tercera elución repitiendo los pasos 2.2.17 y 2.2.13 a 2.2.16 para aumentar el rendimiento del virus. Sin embargo, la mayor parte del virus se encuentra en las dos primeras eluciones.
   19. Tras finalizar las eluciones, coloque el virus en hielo o a 4 °C.
   20. Para limpiar las líneas, configure el sistema en formato de bucle cerrado (Figura 3D), con las líneas de desecho recirculando de vuelta al depósito, como se muestra en Figura 3D.
   21. Proceda a limpiar el sistema agregando 250 mL de NaOH 0,5 M y lejía al 400 ppm precalentada a 42 °C.
   22. Haga circular la solución de limpieza a través del sistema durante toda la noche.
       NOTA: Mientras se recircula la solución de limpieza, si la bomba funciona a una velocidad de 50 mL/min, se debería observar una presión de aproximadamente 5 psi. Si la presión supera este valor, el cartucho está sucio, la solución de limpieza debe reemplazarse y el proceso repetirse.
   23. Eluya la solución de limpieza dirigiendo ambas líneas de desecho y la línea de retenido hacia un recipiente de desecho.
   24. Agregue 400-500 mL de agua estéril al depósito y hágala circular a través del sistema y hacia los recipientes de desecho.
   25. Cuando queden aproximadamente 5 mL en el depósito, detenga la bomba y agregue 100-200 mL de NaOH 0,5 M al tanque del depósito, agitando la solución para lavar el recipiente del depósito.
   26. Una vez que el depósito esté casi vacío, repita el paso 2.2.23 dos veces más.
   27. Desmonte el sistema TFF, almacenando el cartucho TFF y las juntas en un pequeño volumen de NaOH 0,5 M dentro de una bolsa de plástico con cierre hermético a 4 °C.
       NOTA: El tubo puede almacenarse a temperatura ambiente sumergido en NaOH 0,5 M.
3. Ultracentrifugación en gradiente de densidad de yodixanol
   1. Encienda el ultracentrífugo y ajústelo para preenfriar a 4 °C. También preenfríe el rotor deseado a 4 °C (véase la Tabla de Materiales).
      NOTA: Los rotores deben almacenarse a 4 °C.
   2. Utilice la solución stock de yodixanol al 60% (concentración al momento de la compra) para generar soluciones al 40%, 20% y 10% diluyéndolas con PBS y tampón ML 3× hasta alcanzar una concentración final de ML 1×.
   3. En un tubo de ultracentrífuga de pared delgada y extremo abierto de 13,2 mL, superponga 0,5 mL, 2,5 mL y 2,5 mL de las soluciones de yodixanol al 40%, 20% y 10%, respectivamente (Figura 4A).
      NOTA: Inclinando el tubo de ultracentrífuga lateralmente y expulsando lentamente la solución se reduce significativamente el riesgo de mezclar las capas del gradiente. La separación entre cada capa debe ser evidente, con un "halo" visible entre cada capa del gradiente.
   4. Use un rotulador para marcar las interfaces entre las distintas capas del gradiente.
   5. Coloque encima del gradiente de densidad 6-6,5 mL del virus eluido del procedimiento TFF. Añada el virus cuidadosamente como se describe en el paso 2.3.3 para evitar perturbar el gradiente de densidad.
   6. Cargue los tubos de ultracentrífuga en los insertos del rotor de cabezal oscilante (véase la Tabla de Materiales) utilizando una balanza de extremo abierto para equilibrar los insertos entre sí con una diferencia máxima de 0,01 g. Use PBS o eluyente adicional de virus para compensar las diferencias de peso.
   7. Una vez equilibrados los tubos, tápelos y colóquelos en el rotor.
   8. Centrifugue durante 1,5 h a 125.000 × g a 4 °C.
      NOTA: Esto puede realizarse durante la noche si se dispone de un ultracentrífugo con función de inicio diferido.
   9. Tras la ultracentrifugación, retire los tubos usando unas pinzas estériles. Busque la banda objetivo, una banda ancha entre los gradientes del 10% y 20% (Figura 4B).
   10. Suspenda el tubo sobre la boca de un vaso de precipitados utilizando un soporte universal.
   11. Conecte una aguja de 18 G × 1,5 pulgadas a una jeringa de 5 mL y perfore el costado del tubo de ultracentrífuga.
       NOTA: El tubo debe perforarse ligeramente por debajo de la banda objetivo, con la aguja en ángulo ascendente y el bisel hacia arriba, de modo que penetre en la banda objetivo.
   12. Extienda lentamente el émbolo para extraer la banda objetivo.
       NOTA: Mueva la aguja dentro de la banda objetivo para maximizar la extracción del virus. Tenga cuidado de que otras bandas o residuos no se mezclen con la banda objetivo, y evite extraer exceso de solución, ya que esto implicaría el uso de más cartuchos de diálisis.
   13. Una vez extraída la banda objetivo, retire la aguja y deje que la solución restante drene hacia el vaso de desecho. Deposite la banda objetivo en un tubo cónico de 50 mL hasta que se hayan extraído todas las bandas de los demás tubos de ultracentrífuga.
   14. Repita los pasos 2.3.10-2.3.13 hasta que se hayan extraído todas las bandas objetivo de todos los tubos de ultracentrífuga.
   15. Enfoque alternativo para la extracción de las bandas objetivo descrito en los pasos 2.3.10 a 2.3.13
       1. Retire lentamente el líquido que recubre la banda objetivo usando una pipeta. Una vez alcanzada la banda objetivo, extráigala con la pipeta y almacene el virus en un tubo cónico de 50 mL.
          NOTA: Esto permite reutilizar los tubos de ultracentrífuga.
4. Eliminación del yodixanol de la solución viral
   NOTA: La banda que contiene VND aparece a una densidad de yodixanol entre el 15% y el 16%. La concentración de yodixanol en la solución puede determinarse midiendo la absorbancia a 340 nm en referencia a una curva patrón. Este paso puede omitirse, ya que no se observaron efectos adversos ni toxicidad aguda cuando se administraron a ratones C57BL/6 soluciones de yodixanol a esta concentración.
   1. Humedezca previamente un cartucho de diálisis de corte de peso molecular de 10 kDa de 0,5-3 mL sumergiéndolo en PBS durante 1 min.
      NOTA: La membrana de diálisis debe cambiar de una apariencia lisa a una textura arrugada o irregular. Si el volumen de virus extraído supera los 10 mL, deben usarse dos cartuchos de diálisis de 0,5-3 mL o un cartucho de diálisis de 5-12 mL.
   2. Según corresponda, use una jeringa de 5 o 10 mL y una aguja romo de llenado de 18 G × 1,5 pulgadas para recolectar el virus del tubo cónico de 50 mL.
   3. Use la jeringa para introducirse en el cartucho de diálisis, teniendo cuidado de no perforar la membrana, e inyecte el virus.
      NOTA: El cartucho de diálisis puede rotarse para manipular la posición del bolsillo de aire dentro del cartucho. El bolsillo de aire debe eliminarse antes de retirar la aguja del cartucho.
   4. Llene un vaso de precipitados de 1 L con PBS 1× estéril, coloque una barra de agitación y el cartucho de diálisis dentro, y cúbralo. Incube a 4 °C con agitación suave.
      NOTA: Use espuma de poliestireno extruido y una banda elástica para fijar el cartucho de diálisis de modo que flote en el PBS. El cartucho puede hincharse ligeramente debido al tampón ML.
   5. Tras 1-2 h, reemplace con PBS 1× fresco y continúe incubando a 4 °C durante otras 8-10 h con ligera agitación.
      NOTA: Esto también puede hacerse durante la noche.
   6. Reemplace nuevamente con PBS 1× fresco, incubando a temperatura ambiente durante 1-2 h.
5. Concentración de la solución viral
   1. Retire el cartucho de diálisis del tampón de diálisis (Figura 4C) y colóquelo en una bolsa pequeña de plástico con cierre hermético. Agregue 15-25 mL de polietilenglicol de 40% y peso molecular de 20.000 de modo que el cartucho de diálisis quede completamente sumergido.
   2. Incube a temperatura ambiente con agitación suave. Verifique periódicamente el volumen del virus en el cartucho usando una jeringa de 5 o 10 mL y una aguja romo de llenado de 18 G × 1,5 pulgadas.
      NOTA: El tiempo necesario para concentrar el virus variará según el volumen inicial y el volumen final deseado. Normalmente, el volumen final deseado está entre 1 y 1,5 mL, independientemente del volumen inicial del líquido alantoideo. Al verificar el volumen, tenga cuidado de no usar el mismo puerto, ya que esto comprometería la integridad del puerto y podría provocar la mezcla de la solución de polietilenglicol con el virus.
   3. Antes de retirar el virus concentrado del cartucho de diálisis, enjuague brevemente el cartucho con PBS 1× y llene una aguja romo de 18 G × 1,5 pulgadas con aire.
   4. Introduzca la jeringa llena de aire en el cartucho de diálisis y presione el émbolo. Gire el aparato para que el virus concentrado pueda extraerse sin retirar el aire introducido.
   5. Deposite el virus concentrado en un tubo cónico de 50 mL, anotando el volumen dispensado.
   6. Usando la misma jeringa y aguja, inyecte una cantidad adecuada de sacarosa al 60% en el cartucho de diálisis para que, al combinarse con el virus previamente extraído, alcance una concentración final de 5% de sacarosa.
   7. Use los dedos con guantes para masajear la membrana y desprender el virus residual que podría haberse adherido, teniendo cuidado de no dañarla. Retire algo del exceso de aire en el cartucho de diálisis para facilitar el proceso de desprendimiento.
   8. Combine este lavado con el virus ya presente en el tubo cónico de 50 mL.
      NOTA: El virus ahora está en sacarosa al 5% y listo para fraccionarse en alícuotas de 20 µL, 50 µL, 100 µL o 200 µL y almacenarse a -80 °C. Alternativamente, para almacenamiento a largo plazo, el VND puede liofilizarse y almacenarse a 4 °C como se describe en la sección 2.6.

Resultados

Figura 1: Infección y recolección de NDV a partir de huevos de gallina embrionados libres de patógenos específicos. (A) Después de 9 días de incubación, debe observarse una vascularización en forma de red (flechas), además del movimiento del embrión. La 'X' indica la interfase entre la membrana corioalantoidea y la cavidad de aire, y el lugar donde debe crearse el orificio para la inoculación del huevo. (B) Imagen que muestra un embrión muerto. Obsérvese la ausencia de vascularización en forma de red. También se observará falta de movimiento del embrión. (C) Diagrama de los componentes de un huevo de gallina embrionado que muestra las ubicaciones de la cavidad de aire, el saco vitelino, el saco amniótico, la membrana corioalantoidea y el líquido alantoico. (D) Retiro del cascarón para exponer la membrana corioalantoidea. (E) Ilustra cómo deben verse el líquido alantoico y el embrión tras la apertura de la membrana corioalantoidea. Abreviatura: NDV = virus de la enfermedad de Newcastle.

Figura 2: Esquema que muestra el montaje general del aparato utilizado para la filtración por profundidad. Asegúrese de que el manómetro esté instalado aguas arriba del filtro de profundidad.

Figura 3: Configuración del sistema de filtración de flujo tangencial en sus diferentes configuraciones. Las flechas indican la dirección del flujo de líquido. (A) Ilustración de cómo se ensambla el cartucho de FTF. (B) Esquema del sistema de FTF en su configuración «abierta», utilizada durante la purificación y concentración del líquido. (C) Esquema del montaje de FTF cuando se está eluyendo el líquido del sistema, como se utiliza durante la elución del virus y de la solución de limpieza. (D) Esquema del sistema de FTF en su configuración «cerrada», que se utiliza durante la limpieza del sistema de FTF. Abreviatura: FTF = Filtración de flujo tangencial.

Figura 4: Ultracentrifugación en gradiente de densidad y diálisis del virus concentrado a partir de TFF. (A) Esquema que muestra la composición del gradiente de densidad de iodixanol. (B) Patrón de bandeo del virus tras la ultracentrifugación del virus producido utilizando el tampón ML durante el proceso de purificación. La banda principal que contiene el virus se indica mediante un óvalo negro. (C) Tamaño típico de un casete de diálisis cargado con 10 mL de virus preparado mediante un gradiente de iodixanol al final del procedimiento de diálisis. Abreviatura: TFF = Filtración tangencial de flujo; ML = Manitol-Lisina.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de punta deslizable de 1 mL	BD	309659
Jeringa Luer-Lok de 10 mL	BD	302995
Solución de povidona yodo al 10%	LORIS	109-08
Tubos cónicos de 15 mL	Thermo-Fisher	14955240
Aguja romo de 18G x 1 1/2 pulgadas	BD	305180
Aguja Precision Glide de 18G x 1 1/2 pulgadas	BD	305196
Aguja de 25 G x 5/8 pulgadas	BD	305122
Jeringa Luer-Lok de 5 mL	BD	309646
Ácido acético, glacial	Thermo-Fisher	A38-212
Agarosa	Froggabio	A87-500G
Alexa-Fluor 488 de cabra anti ratón	Invitrogen	A11001
Centrífuga Allegra X-14	Beckman Coulter	B08861
Persulfato de amonio	BioRad	161-0700
Lejía (5%)	Thermo-Fisher	36-102-0599
Pinzas de punta ancha sin dientes	Thermo-Fisher	09-753-50
Bromofenol azul	Sigma-Aldrich	114405-25G
Soporte para casete Centramate	PALL	CM018V
ChemiDoc XRS+	BioRad	1708265
Incubadora digital de huevos Sportsman 1502	Berry Hill	1502W
D-Manitol	Sigma-Aldrich	M4125-500G
Candilador de huevos	Berry Hill	A46
Etil alcohol (70%)	Thermo-Fisher	BP82031GAL
Conexiones en T roscadas hembra, de nailon, 1/8 pulgadas NPT(F)	Cole-Parmer	06349-50
Kit de humedad	Berry Hill	3030
Iodixanol	Sigma-Aldrich	D1556	Solución al 60% (p/v) de iodixanol en agua (estéril)
Clorhidrato de L-lisina	Sigma-Aldrich	62929-100G-F
Conexiones macho y hembra Luer-Lok a 1/8 pulgadas de rosca nacional, NPT	Cole-Parmer	41507-44
Motor digital Masterflex L/S	Cole-Parmer	RK-07522-20	Bomba peristáltica con pantalla digital
Cabezal de bomba Masterflex L/S de carga fácil para tubos de precisión	Cole-Parmer	RK-07514-10
Tubo de silicona Masterflex (platino) L/S 16	Cole-Parmer	96420-16	Silicona curada con platino BioPharm
Casete Centramate de membrana Omega LV, 100K	PALL	OS100T02
Ultracentrífuga Optima XE-90	Beckman Coulter	A94471
Solución PBS 10X	Thermo-Fisher	BP399-20
Poli(óxido de etileno) Mn promedio 20.000	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Casete de diálisis Slide-a-lyzer (reforzado), 10.000 MWCO, 0,5-3 mL	Thermo-Fisher	66380
Hidróxido de sodio (perlas)	Thermo-Fisher	S318-10
Huevos libres de patógenos específicos	CFIA	NA	El proveedor variará según la ubicación
Sacarosa	Thermo-Fisher	S5-3
Filtro de profundidad Supracap 50	PALL	SC050V100P
Tijeras quirúrgicas	Thermo-Fisher	08-951-5
Rotador Sw41Ti	Beckman Coulter	331362	Utilizado en los pasos del protocolo 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
Rotador SX4750	Beckman Coulter	369702
Adaptador SxX4750 para tubos de fondo cónico	Beckman Coulter	359472
Tubos ultratransparentes de pared delgada para centrífuga (9/16 pulgadas x 3 1/2 pulgadas)	Beckman Coulter	344059
Abrazadera de tornillo para tubos	PALL	88216
Manómetros de uso general	Cole-Parmer	68355-06