Reprogramación de células sanguíneas humanas en células madre pluripotentes inducidas mediante el virus Sendai

Resumen

Fuente: Rim, Y. A., et al. Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de células sanguíneas utilizando virus Sendai y centrifugación. J. Vis. Exp. (2016).

Este video demuestra la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de células mononucleares de sangre periférica humana mediante la reprogramación mediada por virus Sendai. Los factores de transcripción virales activan redes de pluripotencia y suprimen genes de linaje, permitiendo que un subconjunto de células adquiera propiedades de adhesión y establezca colonias de iPSC. El protocolo enriquece y mantiene estas células reprogramadas mediante unión selectiva a una matriz y renovación diaria del medio.

Protocolo

Todos los procedimientos que implican la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del comité de ética institucional (IRB).

1. Transducción mediante virus Sendai

1. Transducción (Día 0)
   1. Recolecte y transfiera las células sanguíneas a un tubo cónico de 15 ml y cuéntelas utilizando un hemocitómetro.
   2. Prepare 3 x 10⁵ células por transducción y centrifugue las células a 515 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
   3. Descarte el sobrenadante por succión y resuspenda las células en 0,5 ml de medio para células sanguíneas.
   4. Transfiera las células a un pocillo de una placa de 24 pocillos no recubierta.
   5. Descongele la mezcla del virus Sendai en hielo y añádala a las células suspendidas. Añada el virus Sendai a las células según las recomendaciones del fabricante.
   6. Selle la placa con una película selladora y centrifúguela a 1.150 x g durante 30 min a 30 °C.
   7. Tras la centrifugación, incube las células a 37 °C en 5 % de CO₂ durante la noche (O/N).
2. Transferencia celular a la matriz de alimentación (Día 1)
   1. Al día siguiente, recubra una placa de 24 pocillos con vitronectina. Diluya la solución de vitronectina en PBS hasta una concentración final de 5 µg/ml. Añada 1 ml de vitronectina a un pocillo de una placa de 24 pocillos e incube a temperatura ambiente (RT) durante al menos 1 hora. Retire la solución de recubrimiento antes de usar. Las placas recubiertas pueden almacenarse a temperatura ambiente hasta por 3 días.
   2. Transfiera todo el medio que contiene las células y el virus al pocillo recubierto.
   3. Recolecte las células restantes con 0,5 ml adicionales de medio fresco para células sanguíneas y añádalas al pocillo que contiene células.
   4. Centrifugue la placa a 1.150 x g durante 10 min a 35 °C.
   5. Tras la centrifugación, retire el sobrenadante, añada 1 ml de medio iPSC y mantenga las células a 37 °C en 5 % de CO₂ durante la noche (O/N).
3. Segunda transferencia celular (Día 2)
   1. Recubra los pocillos de una nueva placa de 24 pocillos con vitronectina al 5 µg/ml, como se describe en el paso 1.2.1. Utilice un pocillo de la placa por cada transducción.
   2. Transfiera la suspensión celular desde la primera placa a la placa de vitronectina recién recubierta.
      NOTA: Si no son necesarias, las células en suspensión pueden descartarse. El procedimiento mencionado en el paso 2.3 puede repetirse 2-3 veces con las células en suspensión. Si se repiten los pasos, recolecte las células.
   3. Mientras tanto, añada 1 ml de medio iPSC (células madre pluripotentes inducidas) al pocillo de la primera placa, para mantenimiento, e incube a 37 °C en 5 % de CO₂ durante la noche (O/N).
   4. Mantenga las células adheridas a 37 °C y 5 % de CO₂ y realice un cambio diario de medio con medio iPSC fresco. Las colonias aparecerán entre los días 14 y 21 tras la transducción.
   5. Centrifugue la placa recién recubierta que contiene las células en suspensión a 1.150 x g y 35 °C durante 10 min.
   6. Tras la centrifugación, incube las células a 37 °C en 5 % de CO₂ durante la noche (O/N).
   7. Al día siguiente, retire el sobrenadante y sustitúyalo por medio iPSC fresco.
      NOTA: El procedimiento mencionado en el paso 1.3 puede repetirse 2-3 veces con las células en suspensión. Si se van a repetir los pasos, recolecte las células del sobrenadante y repita el paso 1.3.
   8. Mantenga las células adheridas con cambios diarios de medio hasta alcanzar una confluencia del 80 %.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Material de plástico
Tubo cónico de 50 ml	SPL	50050
Tubo cónico de 15 ml	SPL	50015
Pipeta desechable de 10 ml	Falcon	7551
Pipeta desechable de 5 ml	Falcon	7543
Placa de 12 pocillos	TPP	92012
Placa de 24 pocillos	TPP	92024
Materiales para la generación y cultivo de iPSC
Kit de Reprogramación CytoTune-iPSC con Virus Sendai	Life Technologies	A16518
Medio TeSR-E8	STEMCELL Technologies	5940	medio para iPSC
Vitronectina	Life Technologies	A14700
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	solución para la disociación de colonias