Análisis de la internalización del virus de la influenza mediante un ensayo de bloqueo con estreptavidina

Resumen

Fuente: Pohl, M. O. & Stertz, S. Medición de la unión e internalización del virus de la influenza A en células A549 mediante citometría de flujo. J. Vis. Exp. (2015)

Este video demuestra el uso de un ensayo de bloqueo con estreptavidina para distinguir entre el virus de la influenza unido a la superficie y el internalizado en células epiteliales pulmonares humanas. La comparación de las señales de fluorescencia muestra que una mayor intensidad después de la incubación indica una internalización viral exitosa.

Protocolo

1. Ensayo de Fijación/Endocitosis

NOTA: Asegúrese de preparar todos los reactivos antes de comenzar el ensayo. Para los tres grupos de control presentados en la sección de resultados (células mock-infectadas, células pretratadas con neuraminidasa y células tratadas con azida de sodio), se requieren pequeñas alteraciones en el protocolo.

1. Prepare 16 tubos de fondo profundo, cada uno conteniendo 200.000 células A549. Junto al conjunto experimental formado por 4 tubos, hay 3 condiciones de control, cada una requiriendo 4 tubos: células mock-infectadas, células pretratadas con neuraminidasa (NA) y células tratadas con azida de sodio. Cada grupo consta de 4 tubos etiquetados como ‘0 min’, ‘0 min + estreptavidina (STV)’, ‘30 min’, ‘30 min + STV’.
2. Centrifugue los tubos a 4 °C durante 3 min a 450 x g. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 200 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
3. Centrifugue los tubos a 4 °C a 450 x g. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 200 µl de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenga 0,3 % de albúmina sérica bovina (BSA), 20 mM de 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) y 1 % de penicilina-estreptomicina (medio de incubación). Incube durante 30 min a 37 °C.
   NOTA: Para el control con neuraminidasa: utilice neuraminidasa bacteriana (por ejemplo, sialidasa de Vibrio cholera) a una concentración de 200 mU/ml diluida en medio de incubación para resuspender las células.
4. Centrifugue los tubos a 4 °C durante 3 min a 450 x g. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 200 µl de PBS. Repita este paso una vez más y luego enfríe los tubos en hielo durante 10 min.
5. Centrifugue los tubos a 4 °C durante 3 min a 450 x g. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 100 µl de virus biotinilado (utilice la concentración de virus determinada en la sección 2 diluida en PBS de infección). Incube 1 h en hielo.
6. Centrifugue los tubos a 4 °C durante 3 min a 450 x g. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 200 µl de PBS. Repita este paso una vez más.
   NOTA: Para el control mock-infectado: utilice PBS de infección sin virus. Para el control con azida de sodio: utilice virus diluido en PBS de infección suplementado con 0,1 % de azida de sodio.
7. Procesamiento de las muestras tras la infección en hielo:
   1. Para las muestras de ‘0 min’, siga el paso 2.5 y almacene las muestras a 4 °C hasta que el resto de muestras sean fijadas.
   2. Para las muestras de ‘0 min + STV’, centrifugue los tubos a 4 °C durante 3 min a 450 x g. Retire el sobrenadante y resuspenda los pellets en 50 µl de STV (utilice la concentración determinada en la sección 3) diluida en PBS que contenga 2 % de BSA y 0,1 % de azida de sodio (para prevenir la internalización durante el manejo de la muestra). Incube 30 min en hielo.
   3. Centrifugue los tubos a 4 °C durante 3 min a 450 x g. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 200 µl de PBS. Repita este paso una vez más.
   4. Para la fijación, centrifugue los tubos a 4 °C durante 3 min a 450 x g. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 100 µl de paraformaldehído (PFA) al 3,7 %. Incube durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Luego, repita el paso de lavado descrito en 1.6) y almacene las muestras a 4 °C.
   5. Para las muestras de ’30 min’, centrifugue los tubos a 4 °C durante 3 min a 450 x g. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 200 µl de PBS que contenga 2 % de BSA. Incube 30 min a 37 °C. Siga los pasos 1.7.3-1.7.4 y almacene las muestras a 4 °C.
      NOTA: Para el control con azida de sodio: utilice PBS suplementado con 2 % de BSA y 0,1 % de azida de sodio para la incubación de 30 min a 37 °C.
   6. Para las muestras de ’30 min + STV’, centrifugue los tubos a 4 °C durante 3 min a 450 x g. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 200 µl de PBS que contenga 2 % de BSA. Incube 30 min a 37 °C. Luego, centrifugue los tubos a 4 °C durante 3 min a 450 x g. Retire el sobrenadante y resuspenda los pellets en 50 µl de STV (utilice la concentración determinada en la sección 3) diluida en PBS que contenga 2 % de BSA y 0,1 % de azida de sodio (para prevenir la internalización durante el manejo de la muestra). Incube 30 min en hielo. Siga los pasos 1.7.3-1.7.4 y almacene las muestras a 4 °C.
      NOTA: Para el control con azida de sodio: utilice PBS suplementado con 2 % de BSA y 0,1 % de azida de sodio para la incubación de 30 min a 37 °C.
8. Para la permeabilización, centrifugue los tubos a 4 °C durante 3 min a 450 x g. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 100 µl de PBS que contenga 0,5 % de Triton X-100. Incube durante 6 min a temperatura ambiente. Luego, repita el paso de lavado descrito en 1.6).
9. Centrifugue los tubos a 4 °C durante 3 min a 450 x g. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 50 µl de BSA al 2 % diluida en PBS que contenga STV-Cy3. (Tenga en cuenta que la concentración adecuada de STV-Cy3 debe determinarse antes de comenzar el experimento. Comience con una concentración de 1:200 y pruebe diluciones de dos veces hasta 1:2.400. En nuestra experiencia, una dilución de 1:1.000 resultó ser óptima.)
10. Incube 1 h a oscuras a temperatura ambiente. Luego, repita el paso de lavado descrito en 1.6, pero resuspenda el pellet en 200 µl de BSA al 2 % diluida en PBS.
11. Analice las muestras mediante citometría de flujo. Determine el porcentaje de células positivas para Cy3 en cada muestra.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
Penicilina-Estreptomicina	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-Sacarosa	Fluka	84100
Ensayo Bioquímico de Proteínas Bio Rad	Bio Rad	500-0006
Tubos de pozos profundos (microtubos de 1,2 ml)	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem Electron microscopy sciences	15710
Tubos para ultracentrífuga	Hemotec HmbH	253070
Tritón X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
Azida sódica	Fluka	71290
Neuraminidasa/sialidasa bacteriana	Sigma-Aldrich	N6514-1UN