Evaluación de la inhibición del crecimiento bacteriano mediada por fagos mediante mediciones de densidad óptica

Resumen

Fuente: Niu, Y. D., et al. Efectividad de los bacteriófagos para el biocontrol de patógenos transmitidos por alimentos evaluada mediante configuraciones de alto rendimiento. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra un ensayo basado en microplacas para evaluar la actividad lítica de cócteles de fagos contra cultivos bacterianos de E. coli. Destaca cómo los cambios en la densidad óptica revelan la potencia del fago y la concentración necesaria para lograr la inhibición bacteriana completa.

Protocolo

1. Preparación del tampón y los reactivos

1. Prepare 500 mL de caldo tripticasa soya (TSB) (15 g de polvo de TSB y 500 mL de agua ultrapura) y autóclavelo.
   NOTA: Esto se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por 3 meses o a 4 °C hasta por 6 meses.
2. Prepare 500 mL de agar tripticasa soya (TSA) (20 g de polvo de TSA y 500 mL de agua ultrapura) y autóclavelo.
   NOTA: Esto se puede almacenar a 4 °C hasta por 3 meses.
3. Prepare 500 mL de solución salina tamponada con fosfatos (PBS; 4 g de NaCl, 0.1 g de KCl, 0.77 g de Na₂HPO₄, y 0.12 g de KH₂PO₄, 500 mL de agua ultrapura), mida y ajuste el pH a 7.2 ± 0.2 a 25 °C y autóclavelo.
   NOTA: Esto se puede almacenar a 4 °C hasta por 6 meses.
4. Prepare 200 mL de MgSO₄ 1 M (49.294 g y 200 mL de agua ultrapura) y esterilice mediante un filtro de poliéter sulfona de 0.22 µm.
5. Prepare 500 mL de TSB con MgSO₄ 10 mM (mTSB; 15 g de polvo de TSB, 500 mL de agua ultrapura y 5 mL de MgSO₄ 1 M) y autóclavelo; deje enfriar el medio autoclaveado hasta temperatura ambiente. Aplique la técnica aséptica. Utilizando una pipeta serológica, transfiera cuidadosamente 5,0 mL de MgSO₄ 1 M; agite suavemente para mezclar.

2. Preparación del cultivo bacteriano

1. Para preparar el cultivo bacteriano de laboratorio (BRLC), retire el/los vial(es) de stock glicerolado del inventario del congelador y trasládelos al laboratorio.
2. Utilice un asa de inoculación desechable o equivalente, introdúzcala en el vial, retire una porción de inóculo (material congelado semilíquido) y estríe en una placa de TSA o equivalente dentro de una cabina de seguridad biológica de nivel II. Incube la placa a 37 ± 2 °C durante 15−18 h.
3. Guarde las placas de BRLC preparadas en bolsas y almacénelas a 4 °C.
   NOTA: Período general de caducidad del BRLC: 14 días a 4 °C tras su preparación.
4. Inocule una colonia individual de cada cepa de E. coli O157 procedente de las placas de BRLC que se van a analizar en 10 mL de TSB e incube estáticamente a 37 °C durante 18 h hasta alcanzar 9 log10 UFC/mL.
5. Prepare una dilución seriada de los cultivos nocturnos (a la mañana siguiente), utilizando para cada cepa E. coli O157 mTSB que contenga 10 mM de MgSO₄, para obtener una concentración de 4-5 log10 UFC/mL (u otro nivel de inóculo deseado).
6. Mezcle volúmenes iguales de un cultivo nocturno de cada cepa para obtener un total de 4-5 log10 UFC/mL (o según se desee) y así preparar la mezcla bacteriana.
7. Coloque inmediatamente el cultivo bacteriano diluido a 4 °C para su uso posterior.
8. Diluya el cultivo de inóculo 10 o 100 veces y siembre alícuotas de 0,1 mL de estas diluciones en placas de TSA para obtener colonias aisladas.

3. Preparación de soluciones de trabajo de fagos

1. Propague stocks de trabajo con alta titulación para cada fago que se va a tamizar (≥108 PFU/mL) siguiendo los métodos estándar4.
   NOTA: El período general de caducidad para los stocks de fagos es de 3 meses en una botella de plástico a 4 °C después de su generación.
2. Para obtener la titulación deseada, por ejemplo, ~10⁸ PFU/mL para la cinética de lisis, diluya las preparaciones individuales de fagos con mTSB que contenga 10 mM de MgSO₄. Prepare cócteles de fagos mezclando volúmenes iguales de cada stock de trabajo con la misma titulación en todas las combinaciones posibles.

4. Preparación de la cinética de lisis in vitro para fagos individuales y cócteles de fagos

1. Prepare diluciones seriadas de 10 veces de cada fago en las Columnas 1-8 en microplacas estériles de 96 pocillos para configurar el ensayo en microplaca.
   NOTA: Se pueden probar cuatro fagos contra una cepa bacteriana en duplicado, en columnas adyacentes, en cada placa. Las cuatro columnas restantes son para controles, sin fago, así como el blanco de mTSB (Figura 1).
2. Agregue 180 µL de mTSB en los pocillos de las Columnas 1 a 12 de la microplaca de 96 pocillos.
3. Agregue 20 µL de fagos individuales diluidos o cócteles de fagos (~108 PFU/mL) a los pocillos 1-8 de la fila superior de la microplaca (Fila A).
4. Para el control sin fago y el control en blanco, agregue 20 µL de mTSB al pocillo superior de las Columnas 9, 10 y 11.
5. Con una pipeta de 12 canales, realice la dilución en la placa. Transfiera 20 µL de fila a fila. Mezcle bien el contenido mediante aspiraciones y expulsiones suaves repetidas (al menos cinco veces) y cambie las puntas entre cada dilución. Retire 20 µL de la última fila (Fila H).
   NOTA: Se recomienda usar puntas con filtro para prevenir la contaminación cruzada.
6. Prepare un reservorio para cada cepa. Use una pipeta de 1 mL para transferir 2-3 mL del cultivo diluido al reservorio. Para las columnas 1-10, use una pipeta multicanal para agregar 20 µL del cultivo bacteriano diluido a cada pocillo. Cambie las puntas entre cada adición.
7. Cubra e incube la microplaca en las condiciones deseadas (por ejemplo, 37 °C durante 10 h o 22 °C durante 22 h).
8. A las 2 h o en otros intervalos deseados, retire las microplacas del incubador.

Resultados

Figura 1: Diseño sugerido del ensayo en microplaca de 96 pocillos. Se preparan diluciones seriadas de 10 veces de cada fago en los pocillos de las columnas 1 a 8 de microplacas estériles de 96 pocillos. Se pueden probar cuatro fagos frente a una cepa bacteriana por duplicado, en columnas adyacentes, en cada placa. Las columnas restantes son para controles.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suministros, reactivos y equipos esenciales
Sulfato de magnesio heptahidratado	Sigma	1374361
Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+	METTLER TOLEDO	17014382
Pipeta Pipet-Lite LTS L-300XLS+	METTLER TOLEDO	17014405
Pipeta múltiple Pipet-Lite LTS L12-20XLS+	METTLER TOLEDO	17013808
Pipeta Pipet-Lite, Unv. SL-20XLS+	METTLER TOLEDO	17014412
Puntas de pipeta RT LTS 1000µL FL 768A/8, de baja retención	METTLER TOLEDO	30389213
Puntas de pipeta SR LTS 20µL F 960A/5	METTLER TOLEDO	17005860
Reservorio	METTLER TOLEDO	89094-662
Placas microtituladoras estériles, transparentes, de 96 pocillos, fondo plano, de poliestireno, con tapas	Fisher	168055
Agar tripticasa-soya (TSA)	Sigma	105458-0500
Caldo tripticasa-soya (TSB)	Sigma	105459-0500
Esparcidores celulares en forma de T	VWR	76299-566
Instrumentos
Incubadoras microbiológicas compactas	Fisher	50125590H
Varillas agitadoras poligonales	Fisher	14-512-125	longitud: 20 mm
Lector híbrido multipropósito Synergy Neo2	Fisher	BTNEO2M
Software
SAS	SAS Institute	9.4