Marcado de genomas de HSV-1 en replicación con un análogo de nucleósido

Resumen

Fuente: Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Purificación de ADN viral para la identificación de proteínas virales y celulares asociadas. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra la infección de células mamíferas en fase estacionaria con HSV-1 (virus del herpes simple-1), seguida de la replicación del genoma viral mediante la maquinaria de replicación del huésped y viral. Se incorpora un análogo sintético de nucleósido al ADN viral recién sintetizado para marcar los genomas en replicación, los cuales posteriormente se aíslan para el análisis proteómico de las proteínas virales y del huésped asociadas.

Protocolo

1. Cultivo celular, infección viral y marcado con EdC (5-etinil-2′-desoxicitidina) (Figura 1)

El siguiente protocolo implica trabajar con virus. Consulte los protocolos de bioseguridad de su institución respecto al manejo seguro de virus y otros agentes biológicos. Este protocolo fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional de la Universidad de Pittsburgh.

1. Tripsinice una botella de cultivo de tejidos de 150 cm² confluente de células MRC-5 y transfiera las células a una placa de cultivo de tejidos de 600 cm² que contenga 100 mL de DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) más 10 % de suero bovino fetal. Incube a 37 °C en presencia de 5 % de CO₂ durante 3-4 días hasta alcanzar la confluencia y la fase estacionaria. Una placa de 600 cm² confluente contiene aproximadamente 7 x 10⁷ células. Prepare 1 placa para cada condición y 1 placa para cada control negativo correspondiente.² matraz de cultivo celular de células MRC-5 (cepa celular 5 del Medical Research Council) y transferir las células a una placa de cultivo celular de 600 cm² que contenga 100 mL de DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) más 10 % de suero bovino fetal (FBS). Incubar a 37 °C en presencia de 5 % CO₂₂ durante 3 - 4 días para alcanzar la confluencia y la fase estacionaria. Un plato de 600 cm² confluyente contiene aproximadamente 7 x 10⁷ células. Prepare 1 placa para cada condición y 1 placa para cada control negativo correspondiente.
   NOTA: Las células deben alcanzar la fase estacionaria para inhibir la replicación del ADN celular y asegurar que solo el ADNv (ADN viral) sea marcado y purificado en los pasos posteriores.
   NOTA: Cada muestra requiere un control negativo complementario sin marca, preparado utilizando las mismas condiciones de infección y el mismo punto temporal, sin la adición de EdC.
   NOTA: Se debe realizar una versión reducida de este experimento simultáneamente para evaluar la marcación del ADN celular mediante imágenes, utilizando condiciones comparables de crecimiento celular, infección, marcación con EdC y puntos temporales (véase el paso 2).
2. Diluya 7 x 10⁸ PFU (unidades formadoras de placas) de HSV-1 en 7 mL de solución salina tamponada con Tris (TBS) fría. Retire el medio de crecimiento y almacénelo a 37 °C. Para infectar, añada el virus diluido en 7 mL a las células MRC-5 y agite durante 1 h a temperatura ambiente. Tras la adsorción, retire el inóculo, lave con 50 mL de TBS a temperatura ambiente y reemplace por el medio de crecimiento original. Incube a 37 °C en presencia de 5 % CO₂₂Este paso debe realizarse para cada condición experimental y cada control negativo.
   NOTA: Puede lograrse un mayor etiquetado con EdC utilizando mutantes del HSV-1 defectuosos en la expresión de la dUTPasa viral (gen UL50) y/o la uracil glucosilasa (gen UL2). La dUTPasa del HSV-1 presenta baja especificidad de sustrato y puede reducir la activación de varios análogos de nucleósidos.
3. Etiquetar genomas virales con EdC. Siga las instrucciones para etiquetar genomas entrantes (1.3.1.), genomas replicantes (1.3.2.) o horquillas de replicación viral (1.3.3.).
   NOTA: Solo se debe realizar el paso 1.3.1, 1.3.2 o 1.3.3, dependiendo de si en los pasos posteriores se van a analizar genomas entrantes, genomas replicados o horquillas de replicación, respectivamente.
   NOTA: Se puede sustituir EdU o f-ara EdU por EdC. La toxicidad de los análogos de nucleósidos debe monitorizarse y minimizarse.
   1. Utilice stocks preetiquetados para realizar la infección en el paso 1.2 y continúe con el paso 2 o 3 dentro de las 4 h posteriores a la infección (hpi) para investigar el ADNv no replicado (Figura 1A).
      NOTA: Prepare stocks de virus premarcados utilizando el protocolo descrito previamente25. Los stocks de virus deben pasar por una columna G-25 para eliminar cualquier resto de EdC.
   2. Etiquetar vADN en replicación mediante la adición de 5 - 25 µM EdC al medio de cultivo de las células infectadas durante 2 - 4 h (Figura 1B). Antes de añadirlo, diluir EdC en 1 mL de medio de crecimiento.
   3. Para etiquetar horquillas de replicación viral, tras el inicio de la replicación del ADNv (≥4 hpi), pulse etiquete el ADNv en replicación con 5 - 25 µM EdC durante 5-20 min. Para el seguimiento, lavar 3 veces con medio de seguimiento que contenga 25 - 100 µM 2´desoxicitidina (desoxiC), y luego incubar en presencia del medio de caza durante 20-40 minutos adicionales (Figura 1C).
      NOTA: El medio de pulsación y caza debe equilibrarse a 37 °C y 5 % CO₂₂ antes del uso
      NOTA: Para experimentos de pulsación y caza, es importante considerar el tiempo que tardan los nucleósidos en entrar a la célula y ser fosforilados antes de que puedan incorporarse al ADN en replicación. Esto debe determinarse empíricamente.
      NOTA: Para determinar la resolución de los experimentos de pulsación y caza, calcule la tasa de replicación viral bajo las condiciones experimentales utilizadas. Esto puede determinarse mediante PCR cuantitativa de genomas virales durante un curso de tiempo de crecimiento en un solo paso.

Resultados

Figura 1: Enfoques para marcar el ADN del HSV-1. (A) Para analizar el estado del virus entrante, células MRC-5 en reposo en fase G0 se infectan con HSV-1 previamente marcado y los genomas se analizan antes de las 4 hpi para estudiar el ADN viral no replicado. (B) Para analizar el estado del virus replicado, las células MRC-5 se infectan con HSV-1 no marcado y se añade EdC (estrellas naranjas) al medio de cultivo de las células infectadas, incubándose durante 2 - 4 h tras el inicio de la replicación del ADN viral (≥4 hpi). (C) Para analizar las horquillas de replicación viral, las células infectadas se marcan brevemente con EdC durante 5-20 min. Las horquillas de replicación pueden luego seguirse con deoxyC. El ADN marcado con EdC aparece en naranja. Esta figura ha sido modificada a partir de Dembowski y DeLuca

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Células MRC-5	ATCC	CCL-171
Suero bovino fetal (FBS)	Gibco	26140-179
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)	Gibco	12800-082	Sustituido con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 12 mM (para crecimiento en matraces) o 30 mM (para crecimiento en placas) de bicarbonato de sodio
Placa de cultivo celular de 600 cm²	Thermo Fisher Scientific	166508
Solución salina tamponada con Tris (TBS), pH 7,4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricina
Stock de HSV-1			Los stocks con títulos superiores a 1x10⁹ PFU/mL funcionan mejor
5′-Ethinil-2′-desoxicitidina (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Disolver en DMSO para preparar un stock de 40 mM, alícuotas y almacenar a -20 °C
Incubadora de cultivo celular
Cabina de seguridad biológica
Bloques térmicos			65 °C y 95 °C