Aislamiento de proteínas a partir de complejos ADN viral-proteína

Resumen

Fuente: Dembowski, J. A., et al. Purificación de ADN viral para la identificación de proteínas virales y celulares asociadas. J. Vis. Exp. (2017).

Este video demuestra el aislamiento de complejos de ADN viral–proteína a partir de núcleos celulares mediante química click y purificación con perlas magnéticas. El protocolo incluye la marcación de genomas virales con nucleótidos modificados con alquino, biotinilación mediante una reacción click y unión a perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Tras el lavado y la elución por calor, los complejos purificados se recogen, congelan rápidamente y almacenan para su análisis posterior.

Protocolo

1. Purificación de vADN y proteínas asociadas

NOTA: Todos los tampones y reactivos deben enfriarse en hielo antes de su uso, y todos los pasos deben realizarse en hielo, a menos que se indique lo contrario.

1. Recoger núcleos. NOTA: Antes del aislamiento de núcleos, se puede usar formaldehído para entrecruzar proteínas con el ADN. Así, se pueden usar condiciones de lavado más estrictas durante la purificación del ADN en perlas recubiertas con estreptavidina.
   1. Reemplace el medio de crecimiento con 20 mL de tampón de extracción de núcleos (NEB) e incube durante 20 min a 4 °C con agitación intermitente. Los núcleos serán visibles al microscopio.
   2. Desprenda los núcleos de la placa usando una espátula para células y transfiéralos a un tubo cónico de 50 mL. Centrifugue durante 10 min a 2.500 x g a 4 °C para formar el pellet de núcleos, deseche el sobrenadante.
      NOTA: Se puede usar tinción con azul de tripano para verificar el aislamiento de núcleos a partir de células.
   3. Despegue suavemente el pellet nuclear en 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), transfiéralo a un tubo cónico de 15 mL y haga el pellet mediante centrifugación durante 10 min a 2.500 x g a 4 °C. Elimine completamente el PBS.
      NOTA: Los núcleos se pueden congelar y el protocolo puede detenerse en este punto. Para ello, resuspenda suavemente el pellet nuclear en 500 µL de tampón de congelación e incube el tubo en un baño de etanol/hielo seco. Almacene los núcleos congelados a -80 °C. Antes del uso, descongele los núcleos a temperatura ambiente, transfiéralos rápidamente al hielo, agregue 10 mL de PBS, agite suavemente para mezclar, haga el pellet mediante centrifugación durante 10 min a 2.500 x g a 4 °C y elimine completamente el PBS. La congelación de los núcleos puede resultar en un rendimiento reducido.
2. Conjugar covalentemente biotina-azida al ADN viral marcado con 5-etinil-2′-desoxicitidina (EdC) o vADN.
   1. Resuspenda el pellet nuclear en 10 mL de mezcla de reacción de "click" [véase Tabla de Materiales] pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces con una pipeta de 10 mL.
      NOTA: Es importante que los reactivos incluidos en la mezcla de reacción de "click" se añadan en el orden indicado.
   2. Agite rotando durante 1 h a 4 °C. Mientras tanto, prepare y enfríe los tampones B1, B2 y B3 [véase Tabla de Materiales].
   3. Haga el pellet de los núcleos mediante centrifugación durante 10 min a 2.500 x g a 4 °C. Elimine completamente la mezcla de reacción de "click" y lave el pellet resuspendiendo suavemente en 10 mL de PBS y centrifugando durante 10 min a 2.500 x g a 4 °C.
   4. Resuspenda suavemente el pellet nuclear en 1 mL de PBS y transfiéralo a un tubo microfuge de 1,5 mL usando una punta de pipeta de gran apertura. Haga el pellet de los núcleos mediante centrifugación durante 10 min a 2.500 x g a 4 °C. Elimine completamente el PBS y congele rápidamente en nitrógeno líquido.
      NOTA: El protocolo puede detenerse en este punto, y los núcleos congelados se pueden almacenar a -80 °C. El ciclo de congelación-descongelación ayuda a la lisis posterior, por lo que se recomienda congelar rápidamente los núcleos incluso cuando se continúe al paso 1.3 el mismo día.
3. Lisis de núcleos y fragmentación del ADN.
   1. Descongele los núcleos en hielo y resuspenda en 500 µL del tampón B1 mediante pipeteo. Incube en hielo durante 45 min.
   2. Sonique las muestras 6 veces durante 30 s cada una a 40 % de amplitud usando una sonda microcónica de 3 mm. Coloque las muestras en hielo durante 30 s entre pulsos. Tras la sonicación, las muestras deben verse claras, no turbias.
      NOTA: Las condiciones de sonicación deben optimizarse para cada sonicador individual.
   3. Haga el pellet de los restos celulares mediante centrifugación a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C. El tamaño del pellet debe reducirse considerablemente. Filtre el sobrenadante a través de un filtro celular de 100 µM y conserve el flujo filtrado.
   4. Agregue 500 µL del tampón B2 al sobrenadante filtrado. Se usarán 900 µL de esta muestra en el paso 1.4.2.
   5. Tome una alícuota de cada condición para el aislamiento de ADN (50 µL o 1/20 del volumen) y agregue 50 µL de solución 2x de dodecilsulfato sódico (SDS)-bicarbonato [véase Tabla de Materiales]. Continúe con el protocolo de aislamiento de ADN.
   6. Tome una alícuota de cada condición para proteína de entrada (50 µL o 1/20 del volumen) y agregue 50 µL de tampón de muestra 2x de Laemmli, congele en nitrógeno líquido y almacene a -80 °C.
4. Unir el ADN biotinilado a perlas recubiertas con estreptavidina.
   1. Prepare las perlas magnéticas Streptavidin T1 transfiriendo 300 µL de suspensión de perlas a un tubo microfuge de 1,5 mL. Prepare un tubo de perlas por muestra. Lave las perlas 3 veces con 1 mL del tampón B2 agitando en vórtex para resuspender, aplicando un imán para separar las perlas y aspirando el tampón de lavado.
      NOTA: Las condiciones de unión optimizadas resultan en un rendimiento máximo y una unión de fondo mínima. Se determinó experimentalmente que las perlas magnéticas Streptavidin T1 tienen una capacidad de unión significativamente mayor que las perlas de agarosa, así como otras perlas de estreptavidina, y menos unión de fondo que las perlas Streptavidin C1 (Figura 1A).
   2. Agregue 900 µL de la muestra del paso 1.3.4 a las perlas lavadas y agite rotando durante la noche a 4 °C.
      Nota: No agite en vórtex las perlas una vez que se ha añadido la muestra.
      NOTA: Si se aíslan cantidades significativas de ADN o proteína en el control negativo sin etiquetar, este paso puede reducirse de toda la noche a 4 h para disminuir la unión de fondo.
5. Lave las perlas y eluya el vADN y las proteínas asociadas.
   NOTA: Se recomienda usar puntas de filtro para los pasos restantes.
   1. Coloque las muestras en una rejilla magnética para tubos microfuge, retire el sobrenadante, resuspenda suavemente en 1 mL del tampón B2 y agite rotando durante 5 min a 4 °C.
   2. Repita el paso 1.5.1 tres veces.
   3. Coloque las muestras en una rejilla magnética para tubos microfuge, retire el sobrenadante, resuspenda suavemente en 1 mL del tampón B3 y agite rotando durante 5 min a 4 °C.
   4. Transfiera 100 µL de la mezcla de perlas (1/10 del volumen) a un tubo nuevo para el aislamiento del ADN unido. Coloque este tubo en el imán, retire el sobrenadante, resuspenda las perlas en 100 µL de solución 1x de dodecilsulfato sódico o solución SDS-bicarbonato y continúe con el protocolo de aislamiento de ADN.
   5. Coloque en el imán el tubo que contiene los 900 µL restantes de la mezcla de perlas del paso 1.5.3, retire el sobrenadante y resuspenda las perlas en 50 µL de tampón de muestra 2x de Laemmli para eluir proteínas y complejos proteína-ADN.
   6. Someta las muestras a ebullición a 95 °C durante 15 min, agite en vórtex, centrifugue brevemente en el microfuge y coloque el imán. Transfiera el eluato a un tubo nuevo, congélelo rápidamente y almacénelo a -80 °C.
      NOTA: Use la tecla de bloqueo de mayúsculas para asegurarse de que los tubos no se abran durante la ebullición.
      NOTA: El protocolo puede detenerse en este punto, y las muestras pueden almacenarse a -80 °C durante varias semanas.
   7. Analice las muestras de proteína mediante tinción con Azul de Coomassie, inmunotransferencia o espectrometría de masas mediante procedimientos estándar. Se muestran resultados representativos en las Figuras 1 y 2.
      NOTA: Para determinar si el rendimiento de proteína es suficiente para espectrometría de masas, se usan 7,5 µL de cada muestra para análisis mediante tinción con Azul de Coomassie y 7,5 µL para inmunotransferencia de una proteína asociada al genoma viral representativa (ICP4, ICP8 o UL42). Se corren al mismo tiempo los mismos volúmenes de lisados del paso 1.3.6 para controlar los niveles de proteína de entrada. La muestra restante (35 µL) se analiza entonces mediante espectrometría de masas.

Resultados

Figura 1: Resultados representativos de la purificación de proteínas. (A) Comparación del rendimiento de proteínas cuando las etapas de purificación se llevaron a cabo utilizando varios tipos diferentes de perlas recubiertas con estreptavidina. La infección se realizó en presencia de EdC (+) para comparar el rendimiento de proteínas o en ausencia de EdC (-) para comparar la unión no específica. Las infecciones y la marcación con EdC se llevaron a cabo, y los complejos ADN-proteína se purificaron utilizando cantidades comparables de diferentes tipos de perlas recubiertas con estreptavidina. Panel superior: Comparación del rendimiento de proteína tras la purificación en perlas de agarosa recubiertas con estreptavidina o Streptavidin M-280. Panel inferior: Comparación del rendimiento de proteína tras la purificación en Streptavidin M-270, M-280, Streptavidin C1 o Streptavidin T1. Se realizó un inmunotransferencia con un anticuerpo contra la proteína viral ICP4. La ICP4 purificada se muestra en la primera banda para comparación. Fue necesaria una exposición más prolongada del panel inferior para observar una intensidad similar de ICP4 en la banda "280" como en el panel superior. (B) Se muestran resultados representativos de la purificación de proteínas en función del tiempo de marcado con EdC. Se realizaron infecciones y marcado con EdC durante 0, 20, 40 o 60 minutos, y los complejos ADN-proteína se purificaron utilizando perlas de estreptavidina T1. Se muestran los resultados de la tinción con Azul de Coomassie (arriba) y del inmunotransferencia (abajo). La inmunotransferencia se realizó con anticuerpos específicos para ICP4, UL42 o GAPDH. La muestra del eluato se tomó del paso 1.5.5 y la del lisado del paso 1.3.6. La flecha indica estreptavidina, mientras que L indica la escalera de proteínas.

Figura 2: Ejemplos de diferentes formas de presentar datos de proteómica. (A) Los gráficos circulares resumen las proteínas identificadas mediante espectrometría de masas de eluidos proteicos asociados con genomas virales purificados a las 6 hpi. Los valores indican el número de proteínas identificadas para cada categoría funcional. T indica el número total de proteínas identificadas. Los colores indican las siguientes categorías: morado - procesamiento de ARN, rojo - transcripción, verde - remodelación de cromatina, naranja - replicación del ADN, amarillo - transporte nuclear, turquesa - citoesqueleto, azul oscuro - proteínas estructurales del VHS y gris - otros/desconocidos. (B) Los diagramas de Venn muestran el solapamiento de proteínas identificadas como asociadas con genomas virales a las 6, 8 o 12 hpi. (C) Un mapa STRING muestra las proteínas enriquecidas en horquillas de replicación viral tras una pulsación de EdC de 5 minutos. Se muestran en el mapa de interacciones funcionales las proteínas humanas enriquecidas en un 5 veces en comparación con el control negativo no marcado, generado mediante STRING con ajustes de datos para mostrar únicamente interacciones de alta confianza. Se utilizaron los nombres de los genes para mapear las interacciones. Los círculos indican proteínas que funcionan en el mismo proceso biológico.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Células MRC-5	ATCC	CCL-171
Suero bovino fetal (FBS)	Gibco	26140-179
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)	Gibco	12800-082	Sustituido con 10 % FBS, 2 mM L-glutamina, 12 mM (para crecimiento en matraces) o 30 mM (para crecimiento en placas) bicarbonato de sodio
Placa de cultivo de tejidos de 600 cm²	Thermo Fisher Scientific	166508
Solución salina tamponada con Tris (TBS), pH 7,4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricina
Stock de HSV-1			Los stocks con títulos superiores a 1x10⁹ PFU/mL funcionan mejor
Columna de Sephadex G-25 (columna de desalado PD-10)	GE Healthcare	17085101
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Etinil-2´-desoxicitidina (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Disolver en DMSO para preparar stock de 40 mM, alícuotas y almacenar a -20 °C
2´-desoxicitidina (desoxiC)	Sigma-Aldrich	D3897	Disolver en agua para preparar stock de 40 mM, alícuotas y almacenar a -20 °C
Tampón de extracción nuclear (NEB)			Preparar recién (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 300 mM sacarosa, 0,5 % Igepal)
Escudilla para células	Bellco glass	7731-22000	Esterilizar en autoclave antes de usar
Solución de azul de tripano	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7,2 (10x)			1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na₂HPO₄, 18 mM KH₂PO₄ (diluir a 1x en agua estéril antes de usar)
Sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO₄·5H₂O)	Fisher Scientific	C489	Preparar stock de 100 mM y almacenar a 4 °C durante hasta 1 mes
(+) Ascorbato de sodio L	Sigma-Aldrich	A4034	Preparar recién stock de 100 mM y mantener en hielo hasta su uso
Azida de biotina	Invitrogen	B10184	Preparar stock de 10 mM en DMSO, alícuotas y almacenar a -20 °C durante hasta 1 año
Mezcla de reacción click			Preparar inmediatamente antes de usar añadiendo los reactivos en el orden indicado (10 mL: 8,8 mL PBS 1x, 200 mL CuSO₄ 100 mM, 25 mL azida de biotina 10 mM, 1 mL ascorbato de sodio 100 mM)
Cóctel completo de inhibidores de proteasas	Roche	11697498001	Disolver en 1 mL de agua para preparar stock 50x, puede almacenarse a 4 °C durante hasta 1 semana, o añadir directamente 1 comprimido a 50 mL de tampón
Tampón de congelación			Preparar recién (7 mL glicerol al 100 %, 3 mL NEB, 200 μL inhibidor de proteasas 50x)
Tampón B1			Preparar recién (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1 % Igepal, inhibidor de proteasas 1x)
Tampón B2			Preparar recién (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 % Igepal, inhibidor de proteasas 1x)
Tampón B3			Preparar recién (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, inhibidor de proteasas 1x)
Procesador ultrasónico Vibra Cell equipado con sonda microtip de 3 mm	Sonics	VCX 130
Filtro para células	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidina T1	Life Technologies	65601
Imán DynaMag-2	Life Technologies	12321D
Rotador mini-tubo	Fisher Scientific	260750F
Tampón de muestra 2x Laemmli			Mezclar 400 mg de SDS, 2 mL de glicerol al 100 %, 1,25 mL de Tris 1 M (pH 6,8) y 10 mg de azul de bromofenol en 8 mL de agua. Almacenar a 4 °C durante hasta 6 meses. Antes de usar, añadir DTT 1 M hasta una concentración final de 200 mM.
Tapa de bloqueo para tubo de 1,5 mL	Fisher Scientific	NC9679153
Reactivos estándar para inmunotransferencia (western blotting)
Kit de tinción azul coloidal NOVEX	Invitrogen	LC6025
Placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos	Corning	3513
Cubreobjetos	Fisher Scientific	12-545-100	Esterilizar en autoclave antes de usar
Portaobjetos	Fisher Scientific	12-552-5
Paraformaldehído al 16 %	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluir al 3,7 % en PBS 1x antes de usar
Albúmina sérica bovina (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	Preparar al 3 % en PBS 1x
Tampón de permeabilización (0,5 % Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	Preparar 0,5 % Triton-X 100 en PBS 1x
Cóctel de reacción click - Kit Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging	Molecular Probes	C10337	Preparar según el protocolo del fabricante
Solución 2x SDS-bicarbonato			2 % SDS, 200 mM NaHCO₃
Tris EDTA (TE) 10x, pH 8,0			100 mM Tris, 10 mM EDTA (diluir a 1x antes de usar)
Microcentrífuga para tubos de 1,5 mL
Centrífuga de banco para tubos de 15 y 50 mL
Incubadora de cultivo celular
Cabina de seguridad biológica
Bloques térmicos			65 °C y 95 °C