Un dispositivo recubierto de silicona impreso en 3D para modelar la infección del tracto urinario asociada al catéter

Resumen

Fuente:
Ocean E. Clarke¹, Romy A. Dop¹, Tom Hasell¹, Joanne L. Fothergill¹, Daniel R. Neill<sup>2

1</sup>Universidad de Liverpool, ² Universidad de Dundee

Este video demuestra el uso de un dispositivo recubierto de silicona impreso en 3D que imita la superficie interna de los catéteres urinarios para simular la infección del tracto urinario asociada al catéter.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las pautas del IRB del instituto.

1. Fabricación aditiva de modelos Flexipeg

1. Imprima clavijas (se requieren 24 clavijas por tapa de clavija) y tapas de clavijas en resina estable a altas temperaturas mediante estereolitografía (altura de capa de 100 μm).
   NOTA: Se utiliza resina estable a alta temperatura para las clavijas, y las tapas de las clavijas se pueden esterilizar en autoclave antes de la experimentación.
2. Imprima en 3D tanto los componentes del molde como las partes del bastidor de tubos de ensayo utilizando el modelado por deposición fundida (FDM) con un 60% de relleno.
   NOTA: Cualquier resina duradera es adecuada para FDM, ya que los moldes y las gradillas de tubos de ensayo se pueden esterilizar con etanol y no requieren estabilidad a altas temperaturas.
3. Asegúrese de que los componentes del modelo se hayan impreso correctamente y elimine cualquier exceso de residuo del proceso de impresión utilizando etanol al 70%.
4. Ensamble el molde de tapete de silicona como se muestra en la Figura 1, sosteniendo los lados en su lugar con cinta adhesiva si es necesario.

2. Preparación del modelo Flexipeg

1. Preparación de esterillas de silicona
   1. Pesar 18 g de base de silicona (base 10:1 a catalizador de polidimetilsiloxano (PDMS), curado por condensación) en un vaso de precipitados y mezclar suavemente con 2 g de catalizador hasta que esté bien combinado.
      NOTA: Evite agitar demasiado la mezcla de silicona para evitar que se formen burbujas dentro del molde.
   2. Vierta la mezcla de silicona combinada en el molde impreso con FDM, limpiando el exceso de mezcla de silicona de los lados y la parte superior del molde. Dejar curar durante la noche (un mínimo de 18 h) a temperatura ambiente (RT).
   3. Retire el tapete del molde y recorte el exceso de silicona de los lados. Asegúrese de que el tapete encaje dentro de la tapa de la clavija, como se muestra en la Figura 1.
2. Recubrimiento de clavijas
   1. Inserte las clavijas en una alfombrilla de silicona (24 clavijas por alfombrilla) y asegure la alfombrilla a la tapa de la clavija o a una bandeja de plástico de dimensiones similares a la alfombrilla con cinta adhesiva.
   2. Pese 27 g de base de silicona en una bandeja de plástico poco profunda (aproximadamente las mismas dimensiones que una placa de 96 pocillos) y mezcle bien 3 g de catalizador hasta que esté bien combinado.
   3. Invierta las tapas de las clavijas para que queden hacia abajo e inmediatamente sumerja las clavijas en la mezcla de silicona. Invierta la tapa de la clavija y deje que el exceso de silicona gotee por las clavijas y que las clavijas se curen durante la noche a temperatura ambiente.
      NOTA: La silicona de curado rápido (6-8 h de curado completo; 40-60 min de tiempo de trabajo) continuará goteando / fluyendo antes del curado; por lo tanto, no es imperativo recubrir toda la clavija con PDMS al sumergirla, ya que cualquier exceso cubrirá el resto de la clavija durante el curado.
   4. Una vez curado, repita los pasos 2.2.2 a 2.2.3. hasta que las clavijas se hayan recubierto tres veces con PDMS. Asegúrese de que la primera capa de recubrimiento esté completamente curada antes de continuar con el segundo paso de recubrimiento.
      NOTA: Los recubrimientos finales de clavijas deben tener un espesor de <2 mm sin imperfecciones visibles. Si la silicona permanece pegajosa después de la incubación nocturna a temperatura ambiente, déjela curar durante 24 h y deseche los recubrimientos si las clavijas aún están pegajosas al tacto.
   5. Con un bisturí estéril, recorte alrededor de la base de las clavijas recubiertas de silicona (lo más cerca posible de la parte inferior) para quitar las clavijas de la configuración del recubrimiento.
      NOTA: Este proceso debe repetirse hasta que se prepare el número deseado de clavijas y tapetes de silicona. El exceso de PDMS utilizado en el proceso de recubrimiento de clavijas se puede utilizar para fundir nuevas esteras de silicona antes del curado.
3. Configuración del modelo
   1. Inserte clavijas recubiertas en el tapete de silicona y asegure el tapete en la tapa de la clavija, como se muestra en la Figura 1.
   2. Cubra la parte inferior de la tapa de la clavija/tapete de silicona (unida a la base de la clavija) con cinta esterilizable en autoclave para mantener las clavijas en su lugar. Coloque la configuración de la tapa de la clavija en una bolsa sellada esterilizable en autoclave y esterilícela en autoclave antes de usarla.
      NOTA: Las clavijas en la tapa de la clavija encajarán en una placa de 96 pocillos en una orientación singular. Después de pegar con cinta adhesiva la configuración de la clavija, verifique la alineación de las clavijas en una placa de repuesto de 96 pocillos y etiquete la cinta del autoclave en consecuencia con la orientación correcta de la tapa.

3. Inoculación de modelos

1. Preparación de cultivo bacteriano
   1. Prepare cultivos nocturnos de aislados bacterianos bajo prueba suspendiendo un bucle lleno de colonias bacterianas cultivadas en medios sólidos en 10 ml de caldo Luria-Bertani (LB). Incubar durante la noche (18 h) a 37 °C con agitación.
      NOTA: Se recomienda un mínimo de tres réplicas biológicas para su uso en el modelo de biopelícula Flexipeg.
   2. Normalice los cultivos a un DO_{de 600 nm}de 0,1 (aproximadamente 10⁸ unidades formadoras de colonias (UFC)/ml después de la dilución en placa) en un volumen final de 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Configuración e inoculación de microplacas
   1. Alícuota de 135 μl de orina humana agrupada (UPS) en cada pocillo de ensayo en una placa de 96 pocillos de acuerdo con la disposición de la placa de la figura 1 (8). Cada pozo representa una réplica técnica (se requiere un mínimo de n = 3 réplicas técnicas por réplica biológica).
      NOTA: Se pueden utilizar medios de orina artificiales (AUM) en lugar de PHU si el usuario lo desea.
   2. Inocular cada pocillo en la prueba con 15 μL del cultivo nocturno normalizado, lo que da como resultado un volumen final del pocillo de 150 μL. Reserve al menos 100 μL de cultivo nocturno normalizado para diluciones seriadas para validar la UFC/mL del inóculo.
   3. Prepare controles negativos alícuotas de 150 μL de PHU estéril solo en los pocillos relevantes.
   4. Después de la configuración de la microplaca, inserte las clavijas en sus respectivos pocillos (según se determinó antes de la esterilización de las clavijas en autoclave) y asegúrese de que la tapa de la clavija esté al ras con la superficie de la placa. Cubra la tapa de la clavija con la tapa de la microplaca, manteniéndola en su lugar con cinta de autoclave si es necesario.
   5. Coloque los modelos de clavijas en una tina/bolsa de plástico sellada con un rollo azul húmedo para evitar la evaporación e incube estáticamente durante 24 h a 37 °C.
3. Validación del inóculo
   1. Alícuota 180 μL de PBS en las filas 2-6 de la primera columna de una microplaca de 96 pocillos y agregue los 100 μL reservados de cultivo nocturno normalizado en el primer pocillo.
   2. Retire 20 μL del cultivo normalizado durante la noche del primer pocillo y colóquelo en alícuotas en el segundo pocillo, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
   3. Repita el paso 3.3.2 hasta que el inóculo inicial se haya diluido en el pocillo final (1 × 10⁵).
   4. Coloque 10 μL de puntos de cada dilución en medios sólidos apropiados por triplicado. Incubar estáticamente durante la noche a 37 °C.
   5. Después de la incubación, cuente el número de colonias en cada punto para calcular la UFC / ml real del inóculo.

4. Cuantificación de biopelículas

1. Procesamiento de trazabilidad
   1. Después de la incubación, retire el modelo de clavija de la microplaca e inviértalo bajo una llama o dentro de un gabinete de seguridad microbiana (clavijas hacia arriba). Deseche las microplacas.
   2. Transfiera la tapa de la clavija a una microplaca nueva que contenga 180 μL de alícuotas de PBS estéril para eliminar las células no adheridas. Repita dos veces en PBS fresco para un total de tres pasos de lavado.
      NOTA: Para evitar daños a las biopelículas asociadas a la superficie, evite romper las clavijas al quitar la tapa de la clavija de cada microplaca (es decir, tocar los bordes del pocillo).
2. Recuento de UFC/ml (asociado a biopelícula)
   1. Trabajando asépticamente bajo una llama o en un gabinete de seguridad microbiológica, configure la gradilla de tubos (fabricada en el paso 1.2.) con tubos de ensayo de vidrio estériles como se muestra en la Figura 1, y coloque la parte superior de la rejilla que se ajusta a la tapa de la clavija.
   2. Asépticamente, alícuota 600 μL de PBS estéril en cada tubo de ensayo.
   3. Coloque la tapa de la clavija en la rejilla, con las clavijas alineadas con los tubos de la rejilla. Retire la cinta de autoclave de la tapa de la clavija.
   4. Con pinzas estériles, empuje las clavijas a través de la tapa de la clavija y dentro de los tubos de ensayo correspondientes alineados a continuación.
   5. Vuelva a colocar las tapas de los tubos y agite cada tubo durante 60 s para desagregar las células asociadas a la biopelícula de la superficie de la clavija.
   6. Retire 100 μL de cada tubo y diluya en serie como se describió anteriormente en el paso 3.3 en PBS estéril.
   7. Utilizando una placa de pipeta serológica, 10 μL de cada dilución en medios sólidos apropiados e incubar estáticamente a 37 °C durante la noche.
   8. Después de la incubación, cuente el número de colonias en cada placa de dilución y utilícelo para calcular la UFC / ml.
3. Tinción de cristal violeta
   1. Alícuota de 180 μL de cristal violeta al 0,1% (p/v) (en agua estéril) en los 24 pocillos de prueba de una microplaca de 96 pocillos.
   2. Inserte el modelo de clavija enjuagada (clavijas y tapa de clavija) en los pocillos correspondientes de la microplaca. Incubar estáticamente a temperatura ambiente durante 20 min.
   3. Después de la incubación, retire el modelo de clavija de la microplaca y deseche la microplaca.
   4. En una bañera del tamaño adecuado, enjuague toda la clavija con agua del grifo mientras agita suavemente. Repita tres veces.
   5. Invierta el modelo de clavijas y deje que las clavijas se sequen completamente a temperatura derecha.
   6. Alícuota 180 μL de ácido acético al 30% en una microplaca fresca de 96 pocillos e inserte el modelo de clavija seca en los pocillos correspondientes. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
   7. Retire el modelo de clavija de la microplaca y lea el DE_{540 nm} de los pocillos teñidos con un lector de microplacas o espectrofotómetro.
   8. Para calcular la formación de biopelículas en las clavijas, promedie el DO_{540 nm} de las clavijas de control negativo teñidas y reste del promedio de las clavijas en la prueba.

Resultados

Figura 1: Una representación esquemática de la configuración del modelo Flexipeg. (1) Un solo Flexipeg, recubierto de polidimetilsiloxano (PDMS) para replicar la superficie del catéter urinario para la formación de biopelículas. (2) El dispo...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microplacas de 96 pocillos	Greiner	650161	Fondo en forma de U/redondo.
Ácido acético	SLS	695092-2.5LSIG	≥ 99,7% de reactivo ACS.
Violeta cristal	Merck	61135-25G
Clavija individual	Interno	Componentes Flexipeg para imprimir en 3D	Fabricación aditiva utilizando resina estable a altas temperaturas (se necesitan 24 clavijas por modelo Flexipeg). Fabricado con resina de alta temperatura Formlabs de Protolabs (NL).
Caldo Luria-Bertani (LB)	Neogen	NCM0088B	Caldo LB (Miller).
Tapa que se adapta a una placa de 96 pocillos	Interno	Componentes Flexipeg para imprimir en 3D	Fabricación aditiva utilizando resina estable a altas temperaturas.
Molde para preparar esterilla de silicona	Interno	Componentes Flexipeg para imprimir en 3D	Fabricación aditiva a partir de cualquier material duradero. Fabricado con resina de prototipado ABS por Protolabs (NL).
Molde para preparar el lado de la esterilla de silicona	Interno	Componentes Flexipeg para imprimir en 3D	Fabricación aditiva a partir de cualquier material duradero.
Solución salina tamponada con fosfato	Merck	P4417-50TAB
Orina humana acumulada	-	-	Recolectado de donantes sanos después de la aprobación ética del comité central de ética de investigación de la universidad.
Gradilla para tubos de vidrio	Interno	Componentes Flexipeg para imprimir en 3D	Fabricación aditiva a partir de cualquier material duradero.
Silicona (PDMS)	MB Fibra de vidrio	GP3481-F	Polycraft Molde de curado por condensación RTV de uso general para fabricación de caucho de silicona.
Tapa que se ajusta a la tapa de la clavija	Interno	Componentes Flexipeg para imprimir en 3D	Fabricación aditiva utilizando resina estable a altas temperaturas.
Catéteres de Foley	Gran Oso Salud Reino Unido Ltd		14 canales, 100% silicona