Purificación de vectores adenovirales con genoma mediante el uso de cloruro de cesio

Resumen

Fuente: Ehrke-Schulz, E., et al. Clonación y Producción a Gran Escala de Vectores Adenovirales de Alta Capacidad Basados en el Adenovirus Humano Tipo 5. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra la purificación de vectores adenovirales de alta capacidad mediante ultracentrifugación en gradiente de cloruro de cesio, lo que permite la separación de viriones que contienen el genoma para aplicaciones en la entrega de genes, caracterización de vectores y estudios terapéuticos preclínicos.

Protocolo

1. Purificación y diálisis de HCAdV (vectores adenovirales de alta capacidad)
   1. Para preparar el lisado viral para gradientes de cloruro de cesio (CsCl), congele la suspensión de células y virus en nitrógeno líquido y descongele en un baño de agua a 37 °C cuatro veces.
   2. Centrifugue el lisado viral a 500 x g durante 8 min a temperatura ambiente (RT) y recoja el sobrenadante que contiene el HCAdV (vectores adenovirales de alta capacidad).
   3. Para la ultracentrifugación, prepare soluciones de CsCl como sigue. Pese 37,5 g (para 1,5 g/cm³), 33,5 g (para 1,35 g/cm³) y 31,25 g (para 1,25 g/cm³) de polvo de CsCl, respectivamente, y complete con dH₂O hasta 25 ml.
      1. Agite hasta que la solución se vuelva transparente y filtre estérilmente las soluciones. Finalmente, retire 1 ml de cada solución y péselo en una balanza de precisión para verificar si la densidad es correcta. 1 ml debe pesar 1,5 g, 1,35 g y 1,25 g, respectivamente.
      2. Si la densidad es demasiado alta, ajústela mediante la adición progresiva de pequeños volúmenes (µl) de dH₂O estéril. Después de añadir dH₂O, mida nuevamente la densidad. Si es necesario, agregue más dH₂O.
      3. Repita el procedimiento hasta que la densidad sea correcta. Si la densidad es demasiado baja, ajústela añadiendo una pequeña cantidad de polvo de CsCl. Vuelva a filtrar estérilmente y verifique la densidad. Si la densidad sigue siendo demasiado alta, ajústela añadiendo dH₂O como se describió anteriormente. Si la densidad aún es demasiado baja, agregue más CsCl, filtre estérilmente de nuevo y compruebe la densidad. Repita el procedimiento hasta que la densidad sea correcta.
   4. Prepare gradientes escalonados de CsCl en 6 tubos transparentes para ultracentrifugación. Pipetee cuidadosa y lentamente las soluciones de CsCl en los tubos en el siguiente orden: 0,5 ml de solución de CsCl a 1,5 g/cm³, 3 ml de solución de CsCl a 1,35 g/cm³ y 3,5 ml de solución de CsCl a 1,25 g/cm³ (Figura 1C).
   5. Coloque ~4,5 ml del sobrenadante clarificado del vector del paso 1.2 sobre la capa de CsCl a 1,25 g/cm³. Centrifugue los gradientes en un ultracentrífugo usando un rotor de balanceo (SW-41) a 12 °C durante al menos 2 h a 226.000 x g (35.000 rpm) con aceleración y desaceleración lentas para separar las partículas virales que contienen el genoma HCAdV de las partículas vacías y los restos celulares.
      NOTA: Bajo condiciones óptimas, se forma una banda difusa de restos celulares en la parte superior de los tubos. Debajo, pueden observarse dos bandas blancas. La banda superior contiene partículas vacías, mientras que la banda inferior corresponde al HCAdV (Figuras 1C y 2A).
   6. Retire cuidadosamente las capas de restos celulares y partículas vacías y recoja 1 ml de la banda inferior de cada tubo, transfiriendo el virus con una punta de pipeta limpia a un tubo estéril de 50 ml. Añada hasta 24 ml de solución de CsCl a 1,35 g/cm³ a las partículas virales recolectadas y mezcle cuidadosamente.
   7. Llene los tubos de centrifugación con la solución de virus-CsCl a 1,35 g/cm³ hasta el borde y centrifugue durante la noche (ON) (18-20 h) a 226.000 x g (35.000 rpm) a 12 °C en un ultracentrífugo usando un rotor de balanceo (SW-41) con aceleración y desaceleración lentas.
   8. Recoja el HCAdV presente en la banda inferior prominente. Dado que una banda superior potencial puede contener partículas vacías, retire las capas superiores desde la parte superior usando una pipeta (ver Figuras 1C y 2B). Luego, retire la banda inferior usando una pipeta.
   9. Somete las partículas virales recolectadas a diálisis para el intercambio de tampón.
      1. Corte una tira de membrana de diálisis (MWCO: 50.000) de aproximadamente 8 cm de longitud, lávela con dH₂O estéril tres veces. Luego cierre un extremo de la membrana de diálisis con una abrazadera plástica y transfiera el virus recolectado del paso 5.8 a la membrana usando una pipeta de 1 ml. Evite la formación de burbujas de aire dentro de la membrana y ciérrela por el otro extremo con una abrazadera plástica para cierre de diálisis.
      2. Realice la diálisis en 1 L de tampón de diálisis (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 % de glicerol y 1 mM MgCl₂ (cloruro de magnesio) en H₂O desionizada) durante 2 h a 4 °C con agitación suave. Cambie el tampón de diálisis por 2 L de tampón fresco y continúe la diálisis durante la noche (ON) a 4 °C con agitación suave. Alternativamente, utilice un tampón de sacarosa (140 mM NaCl (cloruro de sodio), 5 mM Na₂HPO₄·2H₂O (fosfato de disodio), 1,5 mM KH₂PO₄ (fosfato de potasio dihidrógeno) y 730 mM sacarosa, pH 7,8).
      3. Recoja las partículas virales dializadas del paso 1.9.2. usando una pipeta de 1 ml. Prepare múltiples alícuotas de volúmenes pequeños deseados (25-100 µl) y almacene el virus purificado a -80 °C.

Resultados

Figura 1. Resultados representativos del procedimiento de clonación y liberación del genoma del HCAdV (vectores adenovirales de alta capacidad) a partir de pAdVFTC. (A) Liberación del casete de expresión del gen de interés (GOI) a partir de pHM5 mediante digestión con PI-SceI e I-CeuI. (B) Casete de expresión del GOI purificado y pAdVFTC purificado y desfosforilado digerido con PI-SceI e I-CeuI, respectivamente. (C) Digestión analítica con HincII de clones de pAdVFTC con y sin el GOI. (D) Liberación del genoma del HCAdV que porta el GOI a partir de pAdVFTC-GOI mediante digestión con NotI

Figura 2. Resultados representativos tras la gradiente de cloruro de cesio (centrifugación en gradiente de CsCl (A) Después de realizar un gradiente escalonado (véase también el paso 1.5); (B) Después de la gradiente continua (ver también el paso 1.7).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos ultracentrífugos Ultra Clear	Beckmann Coulter	344059	centrifugación en gradiente de densidad
Ultracentrífuga	Beckmann Coulter		centrifugación en gradiente de densidad
Rotor SW-41	Beckmann Coulter		centrifugación en gradiente de densidad
Membrana Spectrapor de Spectrum Laboratories	VWR	132129	tubo de diálisis
Casetes de diálisis listos para usar	Thermo	66383	diálisis
Cloruro de cesio	Carl Roth	8627.1	centrifugación en gradiente de densidad
Medio LB	Carl Roth	X968.3	medio de crecimiento bacteriano
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	tampón de diálisis/tampón de lisis
Glicerol 99,5%	Carl Roth	3783.1	tampón de diálisis
MgCl₂ 98,5%	Carl Roth	KK36.2	tampón de diálisis
NaCl	Carl Roth	3957.1	tampón de diálisis opcional
KH₂PO₄	Carl Roth	3904.2	tampón de diálisis opcional
Sacarosa	Carl Roth	9286.1	tampón de diálisis opcional
Na₂HPO₄·2H₂O	Carl Roth	4984.2	tampón de diálisis opcional
Tubos de 1,5 ml	sarstedt	72,730,005	almacenamiento de preparaciones virales a -80 °C