Entrega de genes virales en el corazón de ratón para evaluar los efectos génicos sobre la función cardíaca

Resumen

Fuente: Lu, A., et al. Expresión de transgenes virales en corazones de roedores y evaluación del riesgo de arritmia cardíaca. J. Vis. Exp. (2022)

El video demuestra un método para la inyección intramiocárdica guiada por ultrasonido de un vector viral recombinante en un modelo murino. Esta técnica permite la entrega dirigida de genes al corazón para estudiar los efectos de la expresión del transgen en la función cardíaca.

Protocolo

1. Expresión viral de transgenes en tejidos ventriculares de roedores

NOTA: Almacene el adenovirus recombinante o el virus adenoasociado (AAV) que expresa el gen diana y el virus control correspondiente, como Ad-GFP (proteína fluorescente verde) (título de 1 x 10¹⁰ unidades formadoras de placas [PFU]/mL) o AAV9-GFP (título de 1 x 10¹³ copias del genoma [GC]/mL) (ver Tabla de Materiales), en un −80 °C congelador

1. El día de la inyección del virus, descongele el virus sobre hielo. Aspire el virus que expresa el gen diana y el virus control en dos jeringas separadas (volumen = 50 µL) con agujas de 30 G ½ y manténgalas sobre hielo hasta su uso.
   NOTA: Cualquier burbuja en la jeringa y la aguja debe eliminarse cuidadosamente.
2. Administre buprenorfina a ratas o ratones (0,05 mg/kg para ratas, 0,1 mg/kg para ratones, vía subcutánea), una hora después, induzca anestesia con isoflurano al 3% y mantenga el isoflurano al 2% (en oxígeno al 100% con un flujo de 0,5-1,0 L/min) durante el procedimiento subsiguiente.
3. Pinche suavemente el cuerpo del animal (por ejemplo, la cola) con un par de pinzas, y si el animal no responde al pellizco con ningún movimiento corporal, se confirma una anestesia adecuada.
4. Mantenga la temperatura corporal a 37 °C utilizando una almohadilla eléctrica calefactora. Afeite el vello en la región torácica utilizando una cortadora de vello.
   NOTA: Debe tenerse cuidado al usar una almohadilla eléctrica calefactora debido a la posible distribución desigual del calor.
5. Aplique pomada oftálmica a ambos ojos para prevenir el secado de la córnea.
6. Mantenga al animal en posición supina y utilice un sistema de imagen preclínica (véase Tabla de Materiales) para realizar imágenes por ultrasonido del corazón del animal en orientación de eje corto.
   NOTA: Los siguientes pasos se realizan en una cabina de seguridad biológica de nivel II, que proporciona un entorno estéril. Se aplican procedimientos de seguridad estándar, incluidos los relacionados con el manejo seguro de agujas.
7. Esterilice la región torácica inferior izquierda del animal alternando tres rondas de antiséptico a base de yodo o clorhexidina y alcohol, en movimiento circular.
8. Bajo guía de imagen por ultrasonido, inserte la aguja de 30 G 1/2 de la jeringa que contiene el virus preparado en el paso 1.1. en el tórax del animal a través del lado torácico inferior izquierdo del cuerpo.
9. Dirija la punta de la aguja hacia la pared libre anterior del ventrículo izquierdo e inyecte lentamente 10-15 μL del virus. Verifique la inyección exitosa en las imágenes por ultrasonido mediante el aumento del brillo cerca de la punta de la aguja.
   NOTA: La cantidad de virus inyectada en cada sitio no debe exceder los 15 μL para prevenir daño físico en los tejidos miocárdicos.
10. Retire la aguja del corazón e insértela en otras regiones del ventrículo izquierdo para una segunda y tercera inyección de la misma cantidad de virus.
    NOTA: El número total de sitios de inyección lo determina el diseño experimental. Si se requiere expresión focal del transgen, solo se necesita una inyección; si se requiere una expresión transgénica más difusa, generalmente se necesitan múltiples sitios de inyección (de tres a cinco).
11. Después de completar las inyecciones, devuelva al animal a su jaula.
12. Observe cuidadosamente al animal hasta que recupere suficiente conciencia para mantener la recumbencia esternal y devuélvalo a su habitación de alojamiento.
13. Administre clorhidrato de buprenorfina (0,1 mg/kg, dos veces al día para ratones, 0,05 mg/kg, dos veces al día para ratas, vía subcutánea) al animal durante los siguientes 2 días. Devuelva los animales al vivario y observe diariamente cualquier signo inusual de dolor o malestar, y si se detecta alguno, trátelos según los protocolos del comité institucional de cuidado animal.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aguja PrecisionGlide 30 G ½	Becton Dickinson (BD)	305106
Adenoasociado virus (AAV9 que expresa la proteína verde fluorescente [GFP])	Vector Biolabs	7007
Adenovirus (Ad-GFP)	Vector Biolabs	1060
Campana de seguridad biológica (Nivel II)	Microzone Corporation	N/A	Modelo #: BK-2-4
Buprenorfina	Vetergesic	DIN 02342510
Afeitadora eléctrica	WAHL Clipper Corporation	78001
Jeringa Hamilton	Sigma-Aldrich	20701	705 LT, volumen 50 μL
Almohadilla térmica	Life Brand	E12107
Isoflurano	Fresenius Kabi Ltd.	M60303
Ratones (Ctnnb1flox/flox)	Jackson Labs	4152
Ratones (αMHC-MerCreMer)	Jackson Labs	5650
Pomada oftálmica	Systane	DIN 02444062
Rata (Sprague-Dawley, macho)	Charles River	400
Cuchillas de bisturí	Fine Science Tools	10010-00
Mango de bisturí	Fine Science Tools	10007-12
Sistema de imagen preclínica VEVO3100	VisualSonic Inc.	N/A