Transducción de un hígado de rata humanizado mediante vectores de virus adenoasociados

Resumen

Fuente: Hiller, T., et al. Estudio de Vectores Virales en un Modelo de Hígado Tridimensional Repoblado con la Línea Celular de Carcinoma Hepatocelular Humano HepG2. J. Vis. Exp., (2016)

Este video demuestra la entrega de genes mediada por virus adenoasociados en un andamio de hígado de rata humanizado. El vector entrega un transgén que codifica un reportero fluorescente y un ARN de silenciamiento génico a las células hepáticas mediante endocitosis mediada por receptores. Este modelo permite una transducción eficiente en un sistema de tejido hepático tridimensional con perfusión.

Protocolo

Transducción del Modelo de Hígado

1. Ajuste la solución del vector de virus asociado a adenovirus (AAV) a una concentración final de 2.7 x 10¹³ genomas del vector en 5 ml mediante la adición del volumen respectivo de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Desconecte el hígado del circuito de medio retirando el tubo de la cánula. Conecte una jeringa de 5 ml a la cánula de la vena porta e inyecte toda la solución del vector AAV (5 ml).
3. NOTA: Opcionalmente, agregue rojo de fenol (5 µg/ml) para seguir la distribución de la solución del vector AAV a través del hígado.
4. Incube durante 1 h sin bombeo. Aumente gradualmente el caudal, comenzando con 1.25 ml/min durante 10 min; 2.5 ml/min durante 20 min y 3.75 ml/min durante 30 min. Cultive el hígado de rata recelularizado durante 6 días.
5. NOTA: Reemplace un tercio del medio con medio fresco (50 ml) cada dos días. Tome muestras del medio de cultivo para medir parámetros fisiológicos, como la actividad de la lactato deshidrogenasa, el pH de las muestras de medio y la concentración de glucosa y lactato.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Incubadora	Fraunhofer	/
Bomba peristáltica	Fraunhofer	/
Brida con ranura	Duran	2439454
Anillo O transparente	Duran	2922551
Abrazadera de liberación rápida	Duran	2907151
Tapa de brida plana	Duran	2429857
Tubo con rosca	Duran	2483802
Tubo con rosca	Duran	2483602
Anillo de sellado de silicona	Duran	2862012
Tapa roscada	Duran	2924013
Tapa roscada	Duran	2924008
Tapa roscada con apertura	Duran	2922709
Tapa roscada con apertura	Duran	2922705
Filtro	Sarstedt	831,826,001
Tubo de silicona	VWR	228-1500
Conector de tubo	Ismatec	ISM556A
Tubo biocompatible	Ismatec	SC0736
Frascos de cultivo T175	Greiner bio-one	660 160
RPMI 1640	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0501-500
glutamina	BioWest SAS (Th. Geyer)	X0551-100
Tripsina	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0940-100
penicilina/estreptomicina	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0022-100
Suero de ternero fetal	cc pro	S-10-M
HepG2	DSMZ	ACC 180