Confirmación de la transducción viral en hígado de rata recelularizado mediante tinción inmunohistoquímica

Resumen

Fuente: Hiller, T. et. al. Estudio de Vectores Virales en un Modelo Hepático Tridimensional Repoblado con la Línea Celular de Carcinoma Hepatocelular Humano HepG2. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra la tinción inmunohistoquímica para evaluar la transferencia génica viral en un modelo de hígado de rata recelularizado. La expresión del gen reportero, confirmada mediante la detección con anticuerpos y la co-localización con la tinción nuclear, indica una transducción viral exitosa en las células.

Protocolo

1. Transducción del Hígado de Rata Recelularizado

1. Producción a gran escala de vectores virales derivados de virus asociados con adeno (vector AAV)
   1. Producir, purificar y cuantificar vectores AAV:
      1. En resumen, produzca vectores AAV en botellas rotatorias y purifíquelos mediante centrifugación en gradiente de iodixanol. Elimine el iodixanol residual por filtración a través de columnas de filtración por gel PD10. Determine la concentración del vector AAV mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) utilizando ADN genómico de AAV como estándar.
         NOTA: El vector AAV2/6 pseudotipado auto-complementario utilizado en el presente estudio codificaba la proteína fluorescente verde esmeralda, EmGFP, como marcador para demostrar la eficiencia de transducción y un casete de expresión de ARN de horquilla corta (shRNA) para el silenciamiento de un gen expresado endógenamente (ciclofilina B humana (hCycB), Figura 1). Asegure una cantidad suficiente de vectores scAAV pseudotipados del serotipo 6 (2,7 x 10¹³ vectores AAV por modelo de hígado).
2. Transducción del modelo de hígado
   1. Ajuste la solución del vector AAV a una concentración final de 2,7 x 10¹³ genomas vectoriales en 5 mL mediante la adición del volumen correspondiente de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   2. Desconecte el hígado del circuito de medio eliminando el tubo de la cánula. Conecte una jeringa de 5 mL a la cánula de la vena porta e inyecte completamente la solución del vector AAV (5 mL).
      NOTA: Como alternativa, agregue rojo de fenol (5 µg/ml) para seguir la distribución de la solución del vector AAV a través del hígado.
   3. Incube durante 1 hora sin bombeo. Aumente gradualmente el caudal, comenzando con 1,25 ml/min durante 10 minutos; 2,5 ml/min durante 20 minutos y 3,75 ml/min durante 30 minutos. Cultive el hígado de rata recelularizado durante 6 días.

2. Evaluación del hígado de rata recelularizado y transducido

1. Tinción con hematoxilina y eosina (HE) y análisis inmunohistoquímico
   1. Tomar muestras (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) de cada lóbulo hepático utilizando un escalpelo.
   2. Incubar las muestras en solución de paraformaldehído al 4 % (PFA) + sacarosa al 4 % durante 1,5 h a 4 °C. (Precaución: el PFA es tóxico y carcinogénico. Mantenga siempre el PFA dentro de una campana extractora y use ropa protectora adecuada.) Lavar tres veces con PBS (1 min por cada paso de lavado) e incubar en sacarosa al 8 % durante la noche a 4 °C.
   3. Verter el medio de fijación en moldes crioplásticos y colocar las muestras en el medio de fijación, sin burbujas de aire. Añadir medio de fijación hasta que la muestra quede completamente cubierta. Almacenar las muestras embebidas a -80 °C hasta su uso posterior.
   4. Preparar cortes criogénicos (10 µm) con un criotomo. Evaluar la recelularización mediante tinción con hematoxilina y eosina. Evaluar la eficiencia de transducción mediante tinción inmunohistoquímica para el gen de interés (en este caso: EmGFP).

Resultados

Figura 1. Mapa del vector AAV2/6 pseudotipificado auto-complementario utilizado en el presente estudio. El genoma consta de las repeticiones terminales invertidas (ITR) del AAV2 y codifica EmGFP bajo el control del promotor CMV, así como un ARNih bajo el control de un promotor U6.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tissue-Tek O.C.T.	Weckert-Labortechnik	600001
molde criogénico de 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566
incubadora	Fraunhofer	/