Generación de células con knockdown condicional mediante un sistema de expresión de shRNA lentiviral sensible a la tetraciclina

Resumen

Fuente: Kubala, M. H. & DeClerck, Y. A. Silenciamiento condicional de la expresión génica en líneas celulares de cáncer para estudiar la reclutamiento de monocitos/macrófagos al microambiente tumoral. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra la generación de líneas celulares cancerosas con inhibición genética condicional utilizando un sistema de ARNip inducible por Tet basado en lentivirus. Se describen los pasos para la transducción viral, la selección con antibióticos y el silenciamiento génico inducido por doxiciclina.

Protocolo

1. Generación de líneas celulares transducidas de forma estable
   1. Siembre células de cáncer de colon HCT116 y células de cáncer de mama MDA-MB-231 a 50.000 células/pocillo en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) en una placa de 12 pocillos. Incube a 37 °C y 5% de CO₂ hasta que las células alcancen una confluencia del 60 al 70%.
   2. Lave las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y añada 1 mL de medio que contenga virus a las células cancerosas e incube durante la noche a 37 °C y 5% de CO₂. Como control, añada 1 mL de medio DMEM fresco suplementado con 10% de FBS y 1% de Pen/Strep a 2 pocillos con células cancerosas.
   3. Retire cuidadosamente el medio que contiene el virus mediante aspiración. Lave las células con PBS y cambie el medio a DMEM con 10% (v/v) de FBS libre de tetraciclina (FBS Tet-free) y 1% de Pen/Strep.
   4. Después de 72 h, lave las células con PBS y cambie el medio a DMEM con 10% de FBS Tet-free, 1% de Pen/Strep y 1 µg/mL de puromicina para la selección de células transducidas con virus.
      1. Dependiendo de la línea celular utilizada, ajuste la concentración de puromicina para una selección óptima probando un rango de concentraciones de puromicina (0,1, 0,5, 1, 2 y 5 µg/mL) en células no transducidas y eligiendo la concentración más baja en la que no sobrevivan células de control tras 3 días de cultivo.
   5. Seleccione las células transducidas con virus cultivándolas en presencia de puromicina durante 3 a 14 días. Como controles, prepare dos pocillos adicionales con células no transducidas, uno con medio que contenga puromicina y otro sin puromicina. Observe la muerte parcial de las células por puromicina en el pocillo con células transducidas con virus en comparación con los pocillos de control.
      NOTA: Las células no transducidas no crecerán en presencia de puromicina.
   6. Verifique la eficiencia del silenciamiento condicional (KD) en las células de cáncer de colon HCT116 y de cáncer de mama MDA-MB-231 resistentes a puromicina.
      NOTA: La concentración efectiva de doxiciclina variará según la línea celular utilizada y debe titrarse (típicamente entre 100 ng/mL y 2 µg/mL).
      1. Determine la concentración de doxiciclina que no sea tóxica para las células pero eficaz para reducir la expresión de la proteína de interés. En este protocolo, se utilizó con éxito 1 µg/mL in vitro.
      2. Cultive las células durante 72 h en presencia y ausencia de 0,1, 1 y 2 µg/mL de doxiciclina. Verifique el nivel de expresión de la proteína silenciada (en este caso, el inhibidor 1 del activador del plasminógeno (PAI-1)) en el lisado celular mediante análisis por inmunotransferencia (Western blot). Compare las células HCT116 y MDA-MB-231 que expresan de forma condicional ARN de interferencia en forma de horquilla corta (shRNA) con células de control con secuencia aleatorizada.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vector lentiviral Tet-pLKO-puro	Addgene	21915
FBS (libre de tetraciclina)	Omega Scientific	FB-15
Vector psPAX	Addgene	12260
Vector pMD2.G	Addgene	12259
Células HEK293	ATCC	CRL-1573
PBS	Corning	21-031-CV
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)	Corning	10-013-CV
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Corning	21-031-CV
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Puromicina	Sigma-Aldrich	P9620
Doxiciclina hyclato	Sigma-Aldrich	D9891-25g
Medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Corning	10-040-CV
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122