Preparación de una suspensión enriquecida con virus mediante centrifugación con gradiente escalonado de sacarosa

Resumen

Fuente: Vijayraghavan, S. y Kantor, B. Un protocolo para la producción de vectores lentivirales deficientes en integrasa para la eliminación génica mediada por CRISPR/Cas9 en células en división. J. Vis. Exp., (2017)

Este video demuestra un método de ultracentrifugación en dos pasos que utiliza gradientes y cojines de sacarosa para purificar y concentrar partículas virales a partir del sobrenadante de cultivo celular. El procedimiento permite la separación según la densidad de flotación, posibilitando la recuperación de virus intactos adecuados para aplicaciones posteriores.

Protocolo

1. Concentración de Partículas Virales por Ultracentrifugación

NOTA: Utilizamos un método de purificación de doble sacarosa que implica dos pasos: un paso de gradiente de sacarosa y un paso de cojín de sacarosa (Figura 1).

1. Cargue los tubos cónicos de ultracentrifugación en el siguiente orden para crear un gradiente de sacarosa: 0,5 mL de sacarosa al 70 % (disuelta en solución salina tamponada con fosfato 1x [PBS]), 0,5 mL de sacarosa al 60 % (disuelta en DMEM), 1 mL de sacarosa al 30 % (disuelta en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco [DMEM]) y 2 mL de sacarosa al 20 % (disuelta en PBS 1x).
2. Añada cuidadosamente el sobrenadante que contiene el virus al gradiente. Dado que el volumen total del sobrenadante procedente de cuatro placas de 15 cm es de 100 mL, utilice seis tubos de ultracentrifugación por centrifugación para procesar el volumen completo del sobrenadante vírico.
   1. Cada tubo de ultracentrifugación utilizado en este paso tiene una capacidad de volumen de hasta 30 mL (incluido el volumen de sacarosa). Distribuya el sobrenadante vírico de forma equitativa entre los tubos, dejando al menos un 10 % de espacio libre para evitar derrames.
   2. Ajuste el volumen de cultivo a ~20 - 22 mL por placa cuando utilice más de cuatro placas de 15 cm en cada experimento, de modo que el volumen final del sobrenadante vírico combinado pueda acomodarse fácilmente en seis tubos de ultracentrifugación.
   3. Llene los tubos de ultracentrifugación hasta al menos tres cuartas partes de su capacidad total de volumen; de lo contrario, puede ocurrir rotura de los tubos durante la centrifugación, lo que podría provocar pérdida de muestra y/o daños en el equipo.
3. Equilibre los tubos con PBS 1x y centrifugue las muestras a 70 000 x g durante 2 h a 17 °C
   NOTA: Para evitar la alteración de la capa de sacarosa durante la aceleración, configure la ultracentrífuga para que acelere lentamente el rotor hasta 200 rpm durante los primeros 3 min de la centrifugación. De manera similar, configure la ultracentrífuga para que desacelere lentamente el rotor de 200 rpm a 0 rpm durante 3 min al final de la centrifugación.
4. Recoja cuidadosamente las fracciones de sacarosa del 30 - 60 % en tubos limpios (Figura 1). Añada PBS 1x frío a las fracciones combinadas y eleve el volumen hasta 100 mL; mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.
5. Continúe con el paso del cojín de sacarosa superponiendo cuidadosamente la preparación vírica sobre un cojín de sacarosa. Para ello, añada 4 mL de sacarosa al 20 % (en PBS 1x) al tubo, seguido de ~20 - 25 mL de la solución vírica por tubo. Si los tubos están menos de tres cuartas partes llenos, complete con PBS 1x estéril.
6. Equilibre cuidadosamente y centrifugue las muestras a 70 000 x g durante 2 h a 17 °C, como antes. Vierta el sobrenadante y deje que el líquido restante drene invirtiendo los tubos sobre toallas de papel.
7. Aspire las gotas restantes para eliminar todo el líquido del precipitado. En este paso, los precipitados que contienen el virus deberían ser apenas visibles como pequeños puntos translúcidos.
8. Reconstituya los precipitados añadiendo 70 µL de PBS 1x al primer tubo y pipeteando completamente la suspensión, transfiriendo posteriormente la suspensión al siguiente tubo y mezclando como antes, continuando hasta que todos los precipitados estén resuspendidos.
9. Lave los tubos con 50 µL adicionales de PBS 1x frío y mezcle como antes. Asegúrese de que el volumen combinado de la suspensión final sea de ~120 µL y tenga un aspecto ligeramente lechoso; límpielo mediante centrifugación a 10 000 x g durante 30 s en una microcentrífuga de banco.
10. Transfiera el sobrenadante a un tubo microcentrífugo nuevo, prepare alícuotas de 10 µL y almacénelas a -80 °C.
    NOTA: Evite realizar ciclos repetidos de congelación-descongelación en las muestras de lentivirus. Excepto cuando se requiera centrifugación, se deben realizar esfuerzos para llevar a cabo los pasos restantes en campanas de cultivo de tejidos o en salas de cultivo de tejidos designadas, utilizando medidas de bioseguridad adecuadas.

Resultados

Figura 1: Concentración de las partículas virales mediante el protocolo de gradiente de doble sacarosa. Las partículas virales recolectadas del sobrenadante (SN) se cargan sobre un gradiente de sacarosa. Se utilizan soluciones de sacarosa al 70 %, 60 %, 30 % y 20 % para crear el gradiente. Tras la centrifugación, las partículas recolectadas de las fracciones de sacarosa del 30-60 % se cargan adicionalmente sobre un cojín de sacarosa al 20 % y se precipitan. El pellet final que contiene las partículas virales purificadas se resuspende en 1x PBS para su uso posterior.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipo
Ultracentrífuga Optima XPN-80	Beckman Coulter	A99839
Centrífuga de mesa Allegra 25R	Beckman Coulter	369434
Tubos cónicos para ultracentrifugación de fondo cónico	Seton Scientific	5067
Adaptadores para tubos cónicos	Seton Scientific	PN 4230
Rotor oscilante SW32Ti	Beckman Coulter	369650
Tubos cónicos de centrífuga de 50 mL	Corning	430291
Pipetas para cultivo de tejidos, 25 mL	Corning	4489