Evaluación del título lentiviral mediante el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Resumen

Fuente: Vijayraghavan, S., et al. Protocolo para la Producción de Vectores Lentivirales Deficientes en Integrasa para Interrupción Genética Mediada por CRISPR/Cas9 en Células en División. J. Vis. Exp. (2017).

Este video demuestra el uso de un ELISA de p24 para estimar los títulos virales de vectores lentivirales. El ensayo consiste en lisar las partículas virales para liberar p24, capturarla con anticuerpos específicos y detectarla mediante un sistema ligado a peroxidasa que produce un cambio de color medible. Al comparar los valores de absorbancia de las muestras con una curva patrón, se cuantifica el título viral.

Protocolo

1. Estimación de Títulos Virales

1. método de inmunoensayo por enzima vinculada (ELISA) para p24 (proteína de la cápside p24 del virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1) NOTA: El ensayo se lleva a cabo utilizando placas de 96 pocillos de alta unión según las instrucciones del Programa de Vacunas contra el SIDA de los NIH para el Kit de ensayo de captura de antígeno p24 del VIH-1 (ver Tabla de materiales) con modificaciones.
   1. Al día siguiente, lave los pocillos tres veces con 200 µL de Tween 20 al 0,05% en PBS frío (solución PBS-T). Recubra la placa con 100 µL de anticuerpo monoclonal anti-p24 en una dilución de 1:1500 en PBS 1x e incube durante la noche a 4 °C.
   2. Para eliminar la unión no específica, bloquee la placa con 200 µL de BSA al 1% en PBS; lave tres veces con 200 µL de Tween 20 al 0,05% en PBS frío (solución PBS-T) durante al menos 1 h a temperatura ambiente.
   3. Prepare las muestras: Para preparaciones vectoriales concentradas, diluya 1 µL de la muestra 100 veces añadiendo 89 µL de H2O dd y 10 µL de Triton X-100 (concentración final del 10%). Para preparaciones no concentradas, prepare muestras diluidas diez veces (añada 80 µL de H2O dd y 10 µL de Triton X-100 (concentración final del 10%) a 10 µL de la muestra). NOTA: Las muestras pueden almacenarse a -20 °C en este paso durante un período prolongado para su uso posterior.
   4. Prepare los patrones de VIH-1 mediante una dilución seriada de 2 veces (con una concentración inicial de 5 ng/mL).
   5. Diluya las muestras concentradas (de stocks pre-diluidos 1:100) en RPMI 1640 (medio Roswell Park Memorial Institute 1640) suplementado con Tween 20 al 0,2% y BSA al 1% para obtener diluciones de 1:10.000, 1:50.000 y 1:250.000. Diluya las muestras no concentradas (de stocks pre-diluidos 1:10) en RPMI 1640 suplementado con Tween 20 al 0,2% y BSA al 1% para obtener diluciones de 1:500, 1:2500 y 1:12.500.
   6. Aplique las muestras en la placa por triplicado e incube durante la noche a 4 °C.
   7. Al día siguiente, lave los pocillos seis veces e incube a 37 °C durante 4 h con 100 µL de anticuerpo policlonal de conejo anti-p24, diluido 1:1000 en RPMI 1640, 10% de suero bovino fetal (FBS), BSA al 0,25% y suero de ratón normal (NMS) al 2%.
   8. Lave seis veces como se indicó anteriormente e incube a 37 °C durante 1 h con IgG de cabra anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante diluida 1:10.000 en RPMI 1640 suplementado con 5% de suero de cabra normal, 2% de NMS, BSA al 0,25% y Tween 20 al 0,01%.
   9. Lave la placa como se indicó anteriormente e incube con el sustrato de peroxidasa TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbencidina) a temperatura ambiente durante 15 min.
   10. Detenga la reacción añadiendo 100 µL de HCL 1 N. Mida la absorbancia de las muestras a 450 nm utilizando un lector de placas de absorbancia.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos para ELISA de p24
Anticuerpo monoclonal anti-p24	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3537
Estándares de VIH-1	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP968F
Anticuerpo anti-p24 de conejo policlonal	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP451T
Anticuerpo de cabra anti-rabbit peroxidasa IgG	Sigma Aldrich	12-348	Concentración de trabajo 1:1500
Suero de ratón normal, estéril, 500 mL	Equitech-Bio	SM30-0500
Suero de cabra, estéril, 10 mL	Sigma	G9023	Concentración de trabajo 1:1000
Sustrato de peroxidasa TMB	KPL	5120-0076	Concentración de trabajo 1:10,000