Generación de virus adenoasociados recombinantes mediante transfección de plásmidos

Resumen

Fuente: Ding, J., et al. Preparación de rAAV9 para sobreexpresar o silenciar genes en corazones de ratón. J. Vis. Exp. (2016)

Este video demuestra la producción de partículas de virus adenoasociado recombinante mediante la transfección de plásmidos en células de mamífero. Destaca la expresión coordinada de las proteínas Rep, Cap y helper que impulsan la replicación del genoma viral y el ensamblaje de la cápside dentro del núcleo.

Protocolo

1. Transfección de células HEK293 con plásmidos del virus adenoasociado recombinante 9 (rAAV9)

1. Prepare una solución de polietilenimina lineal (PEI) de 1 µg/µl. Disuelva el polvo de PEI en dH₂O libre de endotoxinas calentado a 70-80 °C. Después de enfriar a temperatura ambiente (TA), neutralice la solución a pH 7,0 con HCl 1 M. Esterilice por filtración (0,22 µm) la solución. Aliquote la solución stock de PEI de 1 µg/µl (1.400 µl/tubo) y almacene la solución a -20 °C.
2. Cultive células HEK293 en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) con 10 % de suero bovino fetal (FBS) y 1 % de penicilina/estreptomicina. Cultive las células en un incubador a 37 °C con 5 ± 0,5 % de dióxido de carbono (CO₂).
3. En el día 0, siembre células HEK293 en diez placas de 150 mm, 18-20 horas antes de la transfección, dividiendo células con una confluencia > 90 % en una dilución 1:2.
   NOTA: En el día 1, las células deben alcanzar una confluencia del 90 %.
4. En el día 1, transfecte las células HEK293 con el plásmido rAAV9 (por ejemplo, construcciones rAAV9.cTNT::GFP o rAAV6.U6::shRNA), el plásmido Ad-Helper y el plásmido AAV-Rep/Cap utilizando PEI.
   1. Para 10 placas de células con una confluencia del 90 %, mezcle 70 µg del plásmido AAV-Rep/Cap, 70 µg del plásmido rAAV9 y 200 µg del plásmido Ad-Helper en un tubo cónico de 50 ml.
   2. Si las células tienen una confluencia menor, ajuste la cantidad de ADN proporcionalmente. Por ejemplo, si las células tienen una confluencia del 75 %, reduzca la cantidad de ADN proporcionalmente (75/90 de la cantidad indicada en el paso 1.4.1): mezcle 70 x 75/90 = 58,3 µg del plásmido AAV-Rep/Cap, 70 x 75/90 = 58,3 µg del plásmido rAAV9 y 200 x 75/90 = 166,7 µg del plásmido Ad-Helper en un tubo cónico de 50 ml.
   3. Añada 49 ml de DMEM a temperatura ambiente (sin FBS) al tubo de 50 ml y mezcle bien.
   4. Añada 1.360 µl de solución de PEI para obtener una relación PEI:ADN (v/p) de 4:1. Mezcle bien. Incube a temperatura ambiente durante 15-30 minutos.
   5. Añada 5 ml de la mezcla preparada en el paso 1.4.4 a cada placa de 150 mm (50 ml de mezcla para diez placas de 150 mm).
5. Cultive las células en un incubador a 37 °C con 5 ± 0,5 % de CO₂ durante 60-72 horas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Polietilenoimina, lineal (PM 25.000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Tubo, polipropileno, 36,2 ml, 25 x 87 mm, (cantidad 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Medio DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
Suero bovino fetal	Atlanta Biologicals	S11150
Vector rAAV9	Penn Vector Core	P1967