Purificación de partículas virales recombinantes a partir de células renales humanas transfectadas

Resumen

Fuente: Ding, J. et. al., Preparación de rAAV9 para sobreexpresar o silenciar genes en corazones de ratón. J. Vis. Exp. (2016)

Este video muestra la purificación de partículas virales recombinantes a partir de células humanas de riñón transfectadas. El virus se libera mediante lisis por congelación-descongelación y se purifica utilizando gradientes de iodixanol con filtración asistida por copolímero de bloque.

Protocolo

1. Transfección de células HEK293 con plásmidos de virus adeno-asociado recombinante 9 (rAAV9)
   1. Prepare una solución de polietilenimina lineal (PEI) a 1 µg/µl. Disuelva el polvo de PEI en agua dH₂O libre de endotoxinas calentada a 70-80 °C. Después de enfriar a temperatura ambiente (RT), neutralice la solución a pH 7,0 con ácido clorhídrico (HCl) 1 M. Esterilice por filtración (0,22 µm) la solución. Aliquote la solución stock de PEI a 1 µg/µl (1.400 µl/tubo) y almacénela a -20 °C.
   2. Cultive células HEK293 en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con 10 % de suero bovino fetal (FBS) y 1 % de penicilina/estreptomicina. Cultive las células en un incubador a 37 °C con 5 ± 0,5 % de dióxido de carbono (CO₂).
   3. En el día 0, siembre células HEK293 en diez placas de 150 mm, 18-20 horas antes de la transfección, dividiendo células con una confluencia > 90 % en una dilución 1:2.
      NOTA: En el día 1, las células deben alcanzar una confluencia del 90 %.
   4. En el día 1, transfecte las células HEK293 con el plásmido rAAV9 (por ejemplo, construcciones rAAV9.cTNT::GFP o rAAV6.U6::shRNA), el plásmido auxiliar Ad-Helper y el plásmido AAV-Rep/Cap utilizando PEI.
      1. Para 10 placas de células con 90 % de confluencia, mezcle 70 µg del plásmido AAV-Rep/Cap, 70 µg del plásmido pfrAAV9 y 200 µg del plásmido auxiliar Ad en un tubo cónico de 50 ml.
      2. Si las células tienen menor confluencia, ajuste la cantidad de ADN proporcionalmente. Por ejemplo, si las células tienen una confluencia del 75 %, reduzca la cantidad de ADN proporcionalmente (75/90 de la cantidad indicada en el paso 2.4.1): mezcle 70 x 75/90 = 58,3 µg del plásmido AAV-Rep/Cap, 70 x 75/90 = 58,3 µg del plásmido rAAV9 y 200 x 75/90 = 166,7 µg del plásmido Ad-Helper en un tubo cónico de 50 ml.
      3. Añada 49 ml de DMEM a temperatura ambiente (sin FBS) al tubo de 50 ml y mezcle bien.
      4. Añada 1.360 µl de solución de PEI para obtener una relación PEI:ADN (v/p) de 4:1. Mezcle bien. Incube a temperatura ambiente durante 15-30 minutos.
      5. Añada 5 ml de la mezcla preparada en el paso 1.4.4 a cada placa de 150 mm (50 ml de mezcla para diez placas de 150 mm).
   5. Cultive las células en un incubador a 37 °C con 5 ± 0,5 % de CO₂ durante 60-72 horas.
2. Recolección de células HEK293 transfectadas y purificación de vectores rAAV9
   1. Recolecte las células 60-72 horas después de la transfección. Desprenda y suspenda las células en las placas mediante pipeteo repetido con el medio de cultivo. Transfiera todas las suspensiones celulares a tubos estériles de 50 ml.
   2. Centrifugue las células a 500 x g durante 5 minutos. Re-suspenda el sedimento celular con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en cada tubo y combine todas las suspensiones celulares en un solo tubo de 50 ml.
   3. Centrifugue las células a 500 x g durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante. En este paso, almacene el sedimento celular a -80 °C o purifique inmediatamente el AAV a partir del sedimento, como se describe en los pasos 2.4-2.15.
   4. Prepare el tampón de lisis: 150 mM de cloruro de sodio (NaCl) y 20 mM de clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano (Tris-HCl, pH 8,0). Esterilice por filtración (0,22 µm). Almacene el tampón a 4 °C.
   5. Re-suspenda el sedimento con 10 ml de tampón de lisis.
   6. Congele el lisado a -80 °C o en baño de hielo seco/etanol, luego descongele a 37 °C. Vortexee durante 1 minuto. Repita los ciclos de congelación-descongelación tres veces.
   7. Añada solución de cloruro de magnesio (MgCl₂) al lisado descongelado (para obtener una concentración final de MgCl₂ de 1 mM en el lisado). Añada nucleasa hasta una concentración final de 250 U/ml. Incube a 37 °C durante 15 minutos para disolver las agregaciones de ADN/proteína.
      NOTA: Si las agregaciones de ADN/proteína no se disuelven tras el tratamiento con nucleasa o endonucleasa, homogenice los lisados mediante un homogenizador Dounce durante 20 ciclos.
   8. Centrifugue la muestra a 4.800 x g durante 20 minutos a 4 °C. Recupere el sobrenadante.
   9. Mientras tanto, prepare la solución para gradiente de yodixanol:
      1. Prepare la solución al 17 % mezclando 5 ml de PBS 10x, 0,05 ml de MgCl₂ 1 M, 0,125 ml de cloruro de potasio (KCl) 1 M, 10 ml de NaCl 5 M y 12,5 ml de medio para gradiente de densidad. Ajuste el volumen total a 50 ml con H₂O.
      2. Prepare la solución al 25 % mezclando 5 ml de PBS 10x, 0,05 ml de MgCl₂ 1 M, 0,125 ml de KCl 1 M, 20 ml de medio para gradiente de densidad y 0,2 ml de rojo de fenol al 0,5 % (p/v). Ajuste el volumen total a 50 ml con H₂O.
      3. Prepare la solución al 40 % mezclando 5 ml de PBS 10x, 0,05 ml de MgCl₂ 1 M, 0,125 ml de KCl 1 M y 33,3 ml de medio para gradiente de densidad. Ajuste el volumen total a 50 ml con H₂O.
      4. Prepare la solución al 60 % mezclando 0,05 ml de MgCl₂ 1 M, 0,125 ml de KCl 1 M, 50 ml de medio para gradiente de densidad y 0,1 ml de rojo de fenol al 0,5 % (p/v).
   10. Con una jeringa y aguja, cargue la solución de gradiente de yodixanol en el tubo de polipropileno en el orden de 5 ml al 17 %, 5 ml al 25 %, 5 ml al 40 % y 5 ml al 60 %, comenzando desde el fondo. Coloque encima del gradiente todo el lisado obtenido en el paso 3.8 (14-16 ml). El gradiente, de abajo hacia arriba, es 60 %, 40 %, 25 %, 17 % y la capa de lisado. Llene el tubo con tampón de lisis y tápelo con un tapón.
   11. Centrifugue a 185.000 x g durante 90 minutos a 16 °C.
   12. Recolecte la fracción viral (capa del 40 %) con una jeringa. Introduzca la aguja (calibre 21) en la intersección entre las fracciones del 40 % y 60 %, aspirando únicamente la capa del 40 %.
       NOTA: Evite aspirar la capa del 25 %.
   13. Mezcle la fracción viral con solución estéril de copolímero bloque de polioxietileno-polioxipropileno en PBS (solución stock de copolímero bloque 1:10.000 diluida en PBS) hasta un volumen total de 15 ml. Cargue la mezcla en el tubo de filtración (corte de peso molecular = 100 kD). Centrifugue a 2.000 x g durante 30 minutos a 4 °C.
   14. Deseche la solución del fondo. Reabastezca el tubo de filtración con solución de copolímero bloque en PBS hasta un volumen total de 15 ml. Centrifugue a 2.000 x g durante 20 minutos a 4 °C. Repita este paso dos veces más. Recupere el virus rAAV9 purificado (la fracción por encima del filtro).
   15. Transfiera el rAAV9 purificado del tubo de filtración a tubos de 1,7 ml. Aliquote el rAAV9 purificado (100-400 µl/tubo, según el volumen y título del AAV) y almacénelo a -80 °C.
       NOTA: Evite ciclos repetidos de congelación-descongelación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Polietilenoimina, lineal (PM 25.000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Tubo, polipropileno, 36,2 ml, 25 x 87 mm, (cantidad 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Nucleasa, ultrapura	SIGMA	#E8263-25KU
Medio de gradiente de densidad (Iodixanol)	SIGMA	#D1556-250ML
Unidad de filtro centrífugo con membrana Ultracel-100	EMD Millipore Corporation	#UFC910008
Aguja de pipeteo de laboratorio con extremos romos de 90°, calibre 14, L 6 pulg., con cono chapado en níquel	SIGMA	#CAD7942-12EA
Solución de Poloxámero 188 (solución Pluronic® F-68)	SIGMA	P5556-100ML
Proteasa K	SIGMA	3115828001
DNasa I	Roche	10104159001
Máquina de centrífuga	Thermo Scientific	75004260
Sistema de centrífuga	Beckman Coulter	363118
Ultracentrífuga	Beckman Coulter
Medio DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
Suero bovino fetal	Atlanta Biologicals	S11150
Vector rAAV9	Penn Vector Core	P1967