Inmortalización de células endoteliales mediante la transducción retroviral de oncogenes virales

Resumen

Fuente: McAllister, S. C., Hanson, R. S., et al. Un modelo in vitro para el estudio de la transformación celular por el herpesvirus del sarcoma de Kaposi. J. Vis. Exp.(2017)

Este video demuestra la transducción retroviral de células endoteliales primarias con oncogenes HPV16 E6/E7. Los oncogenes integrados inactivan los supresores tumorales p53 y Rb, prolongando la longevidad celular. La selección con G418 enriquece las células transducidas, obteniendo cultivos endoteliales inmortalizados adecuados para estudios de transformación.

Protocolo

Transducción de células endoteliales (EC) con los genes del Papilomavirus E6 y E7

NOTA: Rutinariamente utilizamos frascos estándar de cultivo de tejidos para cultivar EC primarias. Sin embargo, si se obtiene un crecimiento insatisfactorio de las EC, se debería considerar el uso de frascos de cultivo comerciales.

1. Cultivar células endoteliales primarias humanas microvasculares dérmicas o linfáticas en un incubador humedecido a 37 °C más 5% de CO₂₂ en medio de crecimiento para células endoteliales (EGM; contiene medio basal para células endoteliales [EBM] suplementado con el kit EGM-2 BulletKit [que contiene suero bovino fetal, hidrocortisona, factor de crecimiento fibroblástico humano-B, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento similar a la insulina-1, ácido ascórbico, factor de crecimiento epidérmico humano, antibióticos y heparina]) en un matraz de cultivo celular T75 hasta una confluencia aproximada del 50 %.
2. Para la transducción, cultive las células PA317 LXSN 16E6E7 en un incubador humedecido a 37 °C más 5% de CO₂₂ en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10 % de suero bovino fetal y antimicrobianos en un frasco de cultivo celular T150 hasta que alcancen aproximadamente un 90 % de confluencia. A continuación, incubar durante la noche en 16 mL de medio.
3. Clarifique el medio PA317 mediante centrifugación a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente. × g durante 5 min a temperatura ambiente.
4. Retire el medio EGM del cultivo de EC y superponga las células con 12 mL del medio PA317 clarificado e incube durante 4 h.
   NOTA: Centrifugar 16 mL de medio condicionado a 300 × g durante 5 min produce un pellet compacto que no se altera con la posterior eliminación cuidadosa de 12 mL del sobrenadante clarificado. Sin embargo, si existe preocupación por la transferencia de células PA317 LXSN 16E6E7 a cultivos primarios de EC (la línea celular empacadora crecerá rápidamente más que las EC), entonces se puede realizar la filtración del sobrenadante condicionado a través de un filtro de 0,45 µm 0.45 µm filtrar antes de la transferencia puede realizarse.
5. Reemplace 6 mL del medio PA317 con EGM fresco e incube durante la noche.
6. Reponga medio EGM fresco (12 mL) a las EC e incube durante 48 h adicionales.
7. Para subcultivar las EC, retire el medio y lave con 12 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin cationes, añada 3 mL de una solución comercial de disociación enzimática (por ejemplo, TrypLE) e incube a 37 °C durante 3 min.
8. Transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Suspender el pellet celular resultante en EGM fresco y dividirlo uniformemente en 3 × matraces T75 con un volumen final de 12 mL de EGM por matraz
9. Para seleccionar las células endoteliales transducidas con E6 y E7, añada G418 hasta una concentración final de 200 µg/mL durante dos pasajes, tras los cuales las EC transducidas pueden sembrarse para infección o congelarse en nitrógeno líquido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Células BCBL-1	NIH AIDS Reagent Program	3233
Células PA317	ATCC	CRL-2203
Células endoteliales microvasculares dérmicas neonatales	Lonza	CC-2505
Medio basal EBM-2	Lonza	CC-3156
Kit complementario EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
RPMI
DMEM
PBS con calcio y magnesio