Visualización y evaluación del tamaño de Faustovirus mediante microscopía electrónica

Resumen

Fuente: Bou Khalil, J. Y., et al. Una estrategia rápida para el aislamiento de nuevos Faustovirus a partir de muestras ambientales utilizando Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016).

Este video demuestra la obtención de imágenes de partículas de faustovirus a partir de un cultivo de amebas infectadas mediante microscopía electrónica de transmisión. Se abarca la preparación de la rejilla, la tinción negativa con molibdato de amonio para mejorar el contraste y la visualización del virus bajo el microscopio. El protocolo concluye con la medición del tamaño del faustovirus utilizando las herramientas de software integradas del microscopio.

Protocolo

1. Microscopía electrónica
   1. Después de la primera identificación en las laminillas, evalúe la presencia del virus gigante mediante observación por microscopía electrónica de cultivos del sobrenadante.
   2. Deposite 5 µl de la muestra positiva sobre la rejilla tratada con descarga de gas. Espere aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente.
   3. Seque cuidadosamente la rejilla y coloque sobre ella una pequeña gota de molibdato de amonio al 1 % durante 10 segundos. Deje secar la rejilla durante 5 minutos.
   4. Proceda a la microscopía electrónica a 200 keV.
   5. Coloque la rejilla sobre el portaobjetos; introduzca el portaobjetos en el microscopio. Verifique la vista general del vacío haciendo clic en el icono correspondiente. Cierre las válvulas e inicie la observación con un tamaño de punto 5 y un aumento de x 25,000.
   6. Mida el virus gigante utilizando ImageJ o directamente en el microscopio mediante la herramienta de medición ubicada en la pantalla de adquisición.
      NOTA: Clasifique la muestra en el grupo Faustovirus con un tamaño de cápside de aproximadamente 200 nm.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CEPA de ameba CDC-19	ATCC	Francia	50237
Placas	Cellstar	Francia	655180
Filtros con vacío	Thermo scientific	Francia	BPV4550 / 20170115
Solución salina tamponada con fosfatos	Thermo Fisher scientific	Francia	10010-023
Tinción con DAPI	Life Technologies	Francia	D1306
Parrillas de carbono	Euromedex	Francia	FCF400NI
Molibdato de amonio	VWR internationanl	Francia	21276185
Matraces	SARSTEDT	Alemania	833911
Filtros de 0,22 μm	Milex millipor	Francia	SE2M229104
Ultracentrífuga Sorval WX 80	Thermo scientific	Francia	9102448
Filtros de flujo rápido	Nalgene	Francia	450-0020