Determinación de la distribución del ARN viral en células huéspedes mediante hibridación in situ fluorescente

Resumen

Fuente: Vallery, T. K. & Steitz, J. A. Hibridación fluorescente in situ cuantitativa (FISH) e inmunofluorescencia (IF) de productos génicos específicos en células infectadas con KSHV. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra la hibridación fluorescente in situ para visualizar ARN viral en células infectadas por virus. Describe los pasos involucrados en la hibridación de sondas, la amplificación de la señal y la imagen confocal.

Protocolo

1. Fijación, hibridación y visualización de ARN virales

1. Elimine el medio y las células en exceso. A lo largo de este protocolo, use succión al vacío para eliminar las soluciones y micropipeteo suave para agregar soluciones.
   NOTA: La intensidad del vacío puede reducirse colocando una punta de micropipeta de 200 µL sobre la pipeta Pasteur de vidrio. Reemplace la punta de micropipeta entre cada paso de lavado para prevenir contaminación. Cada paso de lavado debe realizarse rápidamente porque es fundamental que las células nunca se sequen.
2. De inmediato, fije las células con formaldehído al 4% en PBS (solución salina tamponada con fosfato) previamente enfriado sobre hielo durante 30 min. Lave las células tres veces con 200 µL de PBS 1x enfriado a 4 °C e incube durante 5 min a temperatura ambiente o sobre hielo.
   1. Permeabilice las células fijadas con 200 µL de Triton-X al 0,5% en PBS previamente enfriado durante 10 min sobre hielo o con 750 µL de etanol al 70% previamente enfriado a 4 °C durante 1 h (mínimo) hasta 7 d (máximo).
      NOTA: Todos los lavados a lo largo de este protocolo se realizan de la misma manera, salvo que se indique lo contrario. El etanol al 70% afloja el adhesivo entre las cámaras y la portaobjetos, lo que facilita la separación posterior, y también permite una pausa significativa en el protocolo. No obstante, use película de parafina alrededor de la cámara portaobjetos para reducir la evaporación y verifique el nivel del etanol en cada cámara aproximadamente cada 8 h. El etanol al 70% también aplana las células, obteniendo una imagen más nítida, mientras que Triton-X no deshidrata las células ni altera sus dimensiones.
3. Retire cuidadosamente las cámaras para evitar que se agriete la portaobjetos.
   NOTA: Use un dispositivo nuevo para la extracción o uno con muy poco adhesivo residual proporcionado por el fabricante, y retire suavemente las cámaras para evitar que se agriete la portaobjetos. Usar etanol al 70% como reactivo permeabilizante durante 4 h reduce considerablemente la probabilidad de agrietamiento. En caso de una grieta, continúe el protocolo en las cámaras no afectadas por la grieta y tenga en cuenta la mayor tasa de oxidación de las portaobjetos mal selladas (es decir, vida útil reducida durante el almacenamiento).
4. Lave las células una vez con SSC 2x (citrato de sodio y sodio) y luego aplique 45 µL de solución de hibridación compuesta por 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrana, SSC 2x, BSA (albúmina sérica bovina) al 0,1%, 500 µg/mL de ADN (ácido desoxirribonucleico) de esperma de salmón, 125 µg/mL de ARN (ácido ribonucleico) de transferencia (tRNA) de E. coli y complejos de ribonucleósido de vanadilo 1 mM. Incube durante 1 h a 37 °C en una cámara de humedad, que puede ser una placa de Petri de 150 mm con toallitas estériles humedecidas.
   NOTA: Prepare la solución de hibridación fresca al menos una hora antes de usarla. Disuelva primero el sulfato de dextrana en agua, agitando frecuentemente en vórtex e incube en un baño de agua a 37 °C.
5. Calcule la cantidad de oligonucleótidos necesaria para alcanzar la concentración sugerida de 25 µM en 35 µL de solución de hibridación por cámara. Ajuste la concentración del oligonucleótido antisentido según sea necesario. Agregue agua destilada a los oligonucleótidos para llevar el volumen de desnaturalización a 10 µL.
   NOTA: Tras la reacción de marcado, los oligonucleótidos se almacenan en la solución amortiguadora que contiene cacodilato de potasio 0,18 M, Tris-HCl 23 mM, BSA 0,23 mg/mL, CoCl₂ 4,5 mM, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 18 mM, fosfato de potasio 2,7 mM, KCl 6,8 mM, 2-Mercaptoetanol 45 µM, Triton X-100 0,02% y glicerol 2%. Las concentraciones son lo suficientemente altas como para que la dilución con agua lleve la solución de desnaturalización a concentraciones cercanas a 1x TE (10 mM Tris-HCl y 1 mM EDTA), un tampón estándar para desnaturalización de oligonucleótidos.
6. Desnaturalice los oligonucleótidos marcados con digoxigenina (DIG) y/o Alexa Fluor 594 a 95 °C durante 5 min. Luego agregue 35 µL de solución de hibridación fresca por cada cámara prevista a los oligonucleótidos desnaturalizados. Si realiza una hibridación fluorescente in situ (FISH) doble, ambos conjuntos de oligonucleótidos antisentido pueden desnaturalizarse e hibridarse juntos.
7. Elimine la solución de pre-hibridación y luego agregue la solución de hibridación que contiene los oligonucleótidos marcados a las células. Incube durante la noche en la cámara de humedad a 37 °C, protegiendo los oligonucleótidos marcados con fluoróforo con papel de aluminio.
   NOTA: La incubación debe durar al menos 10 h y no más de 24 h.
8. Al día siguiente, lave las células dos veces con SSC 2x durante 10 min a 37 °C y luego dos veces con SSC 1x durante 10 min a 25 °C.
9. Fije las células con formaldehído al 4% en PBS 1x previamente enfriado durante 10-15 min sobre hielo. Luego lave las células con PBS tres veces y permeabilice durante 1 h con etanol al 70% previamente enfriado o durante 10 min con Triton-X al 0,5% en PBS 1x previamente enfriado a 4 °C.
10. Incube las células con anticuerpo anti-digoxigenina (DIG)–isotiocianato de fluoresceína (FITC) 1:200 en PBS 1x con BSA al 0,1% previamente enfriado durante 1 h a 4 °C. Elimine la solución de anticuerpo y lave tres veces con PBS 1x.
11. Fije con formaldehído al 4% en PBS 1x previamente enfriado durante 10-15 min a 4 °C y luego lave tres veces con PBS 1x.
12. Incube las células con 0,4 µg/mL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en PBS 1x con Triton-X al 0,5% previamente enfriado durante 15 min sobre hielo y luego lave tres veces con PBS 1x.
13. Monte las portaobjetos con perlas fluorescentes (opcional) y un medio de montaje. Luego selle la cubreobjetos a la portaobjetos con esmalte transparente.
14. Usando un microscopio confocal, capture imágenes de las muestras dentro de la primera hora hasta una semana tras realizar el protocolo, con un aumento de 630x. Aplique varias capas de esmalte para sellar la cubreobjetos y prolongar la vida del fluoróforo reduciendo la tasa de oxidación.
    NOTA: No use un medio de montaje que contenga DAPI. Al capturar las imágenes, incluya la barra de escala en cada imagen para su posterior cuantificación. Las perlas fluorescentes sirven como controles de intensidad de fluorescencia entre portaobjetos y preparaciones de muestras. Capture las imágenes en la sección media de la célula para la cuantificación en dos dimensiones (2D).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anti-DIG FITC	Jackson Lab Immunologicals	200-092-156
Sulfato de dextrano	Sigma Aldrich	D8906	Grado para biología molecular
Kit de etiquetado con oligonucleótidos DIG	Sigma Roche	#03353583910	2.ª generación
Portaobjetos con ocho cámaras	Nunc Lab Tek II	#154453	El sello azul favorece la tensión superficial, pero también está disponible la separación mediante gel transparente.
Formamida	Sigma Aldrich	F9037	Grado para biología molecular
Complejos de ribonucleósidos de vanadilo	NEB	S1402S