Medición de la inducción espontánea de fagos en bacterias lisogénicas a lo largo del tiempo

Resumen

Fuente: Krishnamurthi, R., et al. Comprensión del impacto de los bacteriófagos templados sobre sus lisógenos mediante transcriptómica. J. Vis. Exp. (2024).

Este video demuestra la enumeración temporal de la inducción espontánea de fagos en Pseudomonas aeruginosa lisogénica mediante la cuantificación de células bacterianas viables (UFC) y partículas fágicas infecciosas (UFPl) a lo largo del tiempo. Al tomar muestras en intervalos definidos durante el crecimiento y analizar tanto la formación de colonias como de placas, el método revela cuándo la inducción espontánea es mínima. Esto permite identificar los puntos temporales óptimos para análisis transcriptómicos posteriores con mínima interferencia lítica.

Protocolo

1. Enumeración directa temporal de la inducción espontánea (Figura 1)

1. Prepare cultivos iniciadores nocturnos de ambos, el lisógeno (por ejemplo, el lisógeno de P. aeruginosa PAO1 que alberga fagos LES (Liverpool Epidemic Strain (LES) bacteriófagos)) y el huésped indicador (PAO1-RifR) (Pseudomonas aeruginosa PAO1 resistente a rifampicina), inoculando una colonia individual en 5 mL de caldo LB (Luria-Bertani), e incubar a 37 °C con agitación a 180 rpm (18–24 h).^R) (resistente a la rifampicina Pseudomonas aeruginosa PAO1) inoculando una colonia individual en 5 mL de LB (caldo Luria-Bertani) e incubando a 37 °C con agitación a 180 rpm (18–24 h).
2. Inocule cultivos frescos de lisógeno y de huésped indicador inocular los cultivos nocturnos en 100 mL de caldo LB en una proporción de 1:100, e incube a 37 °C con agitación (180 rpm).
   1. Monitore el crecimiento del lisógeno midiendo la DO600 y el recuento viable mediante la técnica de Miles Misra. Para ello, tome una muestra de 1 mL de cada cultivo de lisógeno cada hora a partir del momento de la inoculación durante 8 h.₆₀₀ y recuento de viabilidad mediante la técnica de Miles Misra. Para ello, recolecte una muestra de 1 mL de cada cultivo lisogénico cada hora, desde el momento de la inoculación durante 8 h.
   2. Diluya seriamente la muestra inmediatamente después de la recolección agregando 100 µL de la muestra en 900 µL del medio respectivo. Vortexear bien a velocidad máxima, desechar la punta en cada dilución y continuar la serie de diluciones desde 10⁻¹ a 10⁻⁹.
   3. Colocar 10 µL de las diluciones requeridas en triplicado en una placa de agar LB, dejar secar e incubar a 37 °C durante 18–24 h.

   4. Para calcular el número de células bacterianas viables, identifique una dilución con colonias fácilmente contables. Cuente el número de colonias en cada punto y luego utilice la siguiente fórmula:
       

      

      
      NOTA: A medida que crece la cultura del lisógeno, se producirán partículas fágicas activas mediante inducción espontánea. La producción de fagos infecciosos implica que el transcriptoma de la población lisogénica ahora está contaminado con la expresión génica asociada al ciclo de replicación lítica proveniente de la señal de replicación del fago lítico y la respuesta correspondiente de la célula huésped. Por lo tanto, es importante identificar la fase de crecimiento en la que la proporción de células lisogénicas respecto a partículas fágicas infecciosas libres sea máxima, con el fin de limitar en lo posible el ruido de fondo en la transcripción (generado por el transcriptoma del fago lítico) en el conjunto de datos.

3. Para enumerar las partículas de fagos infecciosos en cada muestra temporal, inocule 5 mL de agar bacteriológico estéril al 0,4 % en caldo LB (agar superior) con 100 µL de huésped indicador en fase de crecimiento exponencial intermedia (OD600: 0,4–0,5; en este caso, PAO1-Rif)^Ren presencia de un agente selectivo adecuado (50 µg·mL⁻¹ rifampicina en este caso, ya que la CMI del huésped PAO1 es solo 16 µg·mL⁻¹)
   1. Colocar 10 µL de la misma dilución seriada (véase el paso 1.2.2) sobre la capa de agar superior inoculada, y dejar secar antes de incubar a 37 °C durante 18–24 h.

   2. Para calcular las partículas de fagos infecciosos, identifique una dilución con placas fácilmente contables. Cuente el número de placas en cada punto.
       

      

   3. Encuentre el momento o condición en el que la inducción espontánea por UFC (unidad formadora de colonias) sea mínima para los siguientes pasos experimentales.

Resultados

Figura 1: Diseño experimental para enumerar las UF (unidades formadoras de placas) y las UCF (unidades formadoras de colonias) de un lisógeno a partir de la misma muestra.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
PAO1		6
LESB58		6
Bacteriófagos LES	Inducidos y purificados a partir de LESB58 utilizando norfloxacina.
Caldo Lysogeny (LB)	Merck	1.10285.500
Agar LB	Merck	1.10283.500
Agar Agar	Fisher	A/1080/53
Agar superior	0,4 g de Agar Agar + 2,5 g de caldo LB en 100 mL de agua; autoclavar y usar.	-
Rifampicina	Sigma (Solución stock: 50 mg/mL en metanol - Mezclar bien y esterilizar mediante filtro de 0,22 µm, almacenar a -20 °C hasta su uso)	R3501