Inducción de la replicación lítica del profago para el análisis transcriptómico

Resumen

Fuente: Krishnamurthi, R., et al. Comprensión del impacto de los bacteriófagos templados sobre sus lisógenos mediante transcriptómica. J. Vis. Exp. (2024)

Este video demuestra la inducción de la replicación lítica en un profago integrado en el genoma bacteriano y la captura de los cambios en la expresión génica mediante muestreos temporizados para análisis transcriptómico.

Protocolo

1. Preparación de cultivos lisogénicos no inducidos e inducidos para la extracción de ARN (ácido ribonucleico)

1. Prepare un cultivo fresco nocturno inoculando una colonia individual del lisógeno en 5 mL de LB, e incube a 37 °C con agitación (180 rpm (revoluciones por minuto)) durante 18–24 h.
2. Subcultive el cultivo nocturno en 80 mL de LB (caldo lisogénico) en una proporción de 1:100 en ocho matraces de 250 mL.
3. Etiquete el primer matraz como “no inducido” y los demás como “inducidos”, junto con los puntos temporales en los que se debe recolectar cada muestra (es decir, “inducido t = 0”, “inducido t = 10 min”, “inducido t = 20 min”, etc.; (Figura 1).
4. Después de 90 min de incubación, cuando la DO (densidad óptica) a 600 sea entre 0,1 y 0,2, o en el momento de mínima inducción espontánea (véase la discusión), agregue 4 µL de ácido acético glacial al 1 % (v/v) al matraz no inducido (Figura 1).
   NOTA: Dado que el agente inductor en este trabajo se preparó utilizando ácido acético glacial al 1 % como disolvente, se añadió la misma cantidad de disolvente solo como paso de control. Se pueden considerar controles alternativos según la preparación de diferentes inductores.
5. Agregue los 80 mL de cultivo del matraz no inducido a 720 mL de LB estéril, y añada inmediatamente la solución de parada (fenol al 5 % [v/v] frío con hielo, pH 4,3, etanol al 95 % [v/v]) usando un volumen equivalente al 20 % del volumen del cultivo (160 mL), e incube en hielo durante un mínimo de 30 min y no más de 2 h para estabilizar los transcritos de ARN. Esta es la muestra no inducida.
6. Induzca los cultivos restantes en siete matraces de 250 mL (Figura 1) con la CIMF (concentración inhibitoria mínima final) de un agente inductor adecuado (en este caso, norfloxacina 25 mg·mL−1, preparada en ácido acético glacial al 1 % [p/v], usada a una concentración final de 1 µg·mL−1), mezcle bien e incube a 37 °C con agitación a 180 rpm durante 1 h.
   NOTA: Este paso forzará al cultivo lisogénico a un estado más coordinado de replicación lítica. La mayoría de las células del cultivo comenzarán a producir partículas de fago infecciosas mediante el ciclo lítico.
7. Permita que las células se recuperen agregando 80 mL de cultivo del matraz inducido a 720 mL de LB estéril, lo que diluye eficazmente el agente inductor. Recolecte las células bacterianas de cada matraz cada 10 min desde el tiempo 0 hasta 1 h mediante la adición de la solución de parada, como se mencionó en el paso 1.5.
   NOTA: La solución de parada estabiliza el ARN hasta por 2 h. Sin embargo, para mejorar la estabilidad de la muestra, realice todos los pasos posteriores a 4 °C.
8. Recolecte por centrifugación a 10.000 x g durante 15 min a 4 °C lo antes posible, sin exceder las 2 h posteriores al tratamiento para evitar la degradación del ARN.
9. Deseche el sobrenadante y resuspenda suavemente los pellet bacterianos en el líquido residual utilizando una pipeta automática ajustable antes de transferir cada muestra a un tubo microcentrífugo de 1,5 mL.
10. Centrifugue los tubos microcentrífugos a alta velocidad (13.000 x g) en una microcentrífuga a 4 °C durante 1 min y deseche el sobrenadante residual.
11. Congele rápidamente los pellet sumergiendo cada tubo microcentrífugo sellado en nitrógeno líquido. Esto facilitará la lisis eficiente de las células para la extracción de ARN.
12. Agregue TRIzol (1 mL) a cada pellet congelado y homogenice la suspensión mediante pipeteo (no vortex). Almacene a −80 °C hasta que esté listo para realizar la extracción de ARN para todas las muestras.
    NOTA: El protocolo puede detenerse en este punto.
13. Repita los pasos 1.1–1.13 con tres réplicas biológicas.

Resultados

Figura 1: Diseño experimental para el muestreo de cultivos inducidos y no inducidos para el aislamiento de ARN.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bacteriófagos LES	Inducidos y purificados a partir de LESB58 utilizando norfloxacino.	Este estudio
Caldo de lisogenia (LB)	Merck	1.10285.500
Agar de caldo de lisogenia (LB)	Merck	1.10283.500
Agar Agar	Fisher	A/1080/53
Agar superior	0.4 g de Agar Agar + 2.5 g de caldo LB en 100 mL de agua; autoclavar y usar.	-
Rifampicina	Sigma (Solución stock: 50 mg/mL en metanol—Mezclar bien y esterilizar con filtro de 0.22 µm; almacenar a -20 °C hasta su uso)	R3501
Ácido acético glacial	Fisher 1% (v/v) en agua	10060000
Norfloxacino	Sigma (Solución stock: 25 mg/mL en ácido acético glacial al 1%—Mezclar bien y esterilizar con filtro de 0.22 µm; almacenar a -20 °C hasta su uso; para evitar ciclos de congelación-descongelación, almacenar en alícuotas pequeñas)	N9890
Fenol saturado con tampón citrato pH 4.3	Sigma	P-4682
Etileno molecular de grado biología molecular	Fisher	16695992
TRIzol	Invitrogen	12044977
Cloroformo	Fisher	11398187
Isopropanol	Fisher	17150576
Agua libre de nucleasas	Invitrogen	10526945