Recolección de virus adenoasociado de células mamíferas transfectadas

Resumen

Fuente: Rghei, A. D., et al. Producción de Vectores de Virus Asociado a Adenovirus en Pilas de Células para Estudios Preclínicos en Modelos Animales Grandes. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra la recuperación del virus adeno-asociado crudo a partir de células mamíferas transfectadas mediante lisis química y centrifugación, lo que permite la producción de AAV con alto rendimiento para aplicaciones de purificación posterior y terapia génica preclínica.

Protocolo

1. Aislamiento del AAV (virus asociado a adenovirus) y lisis química de las células HEK293 (riñón embrionario humano 293) transfectadas

1. Agite vigorosamente la cámara de cultivo celular para desprender las células hasta que el medio se vuelva turbio por las células desprendidas y viértalo en cuatro tubos de centrífuga de 500 mL.
2. Centrifugue los tubos a 18,000 x g durante 30 min a 4 °C para obtener el pellet celular. Vierta el sobrenadante clarificado en una botella de 1 L de copoliéster de tereftalato de polietileno (PETG).NOTA: Si no se dispone de una centrífuga de alta velocidad, centrifugue a 12,000 x g durante 40 min. A esta velocidad, el pellet celular puede no ser sólido y se deslizará al verter el sobrenadante.
3. Resuspenda los pellets celulares en tubos de centrífuga de 500 mL con 50 mL de tampón de lisis e incube durante 60 min a 37 °C.
4. Centrifugue los tubos a 18,000 x g durante 30 min, y luego transfiera el sobrenadante a la misma botella de PETG de 1 L. Deseche los restos celulares en pellet.NOTA: Purifique inmediatamente el sobrenadante clarificado y almacénelo a 4 °C durante un máximo de 72 h. Para almacenamiento a largo plazo, almacénelo a -80 °C. No almacene a -20 °C.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pila de celdas de 10 cámaras	Corning	3271
Botella de PETG de 1 L	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con D-glucosa 1000 mg/L, L-glutamina	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Suero bovino fetal (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
Células HEK293	Colección Americana de Cultivos Celulares	CRL-1573	Al recibir las células, descongélelas y cultívelas según se describe en el protocolo del fabricante. Una vez que las células hayan sido pasadas mínimamente y estén creciendo adecuadamente, congele una subfracción en alícuotas para uso futuro y almacénela en nitrógeno líquido. Utilice siempre células con número de pase inferior a 30. Cuando las células cultivadas se hayan pasado más de 30 veces, se recomienda reiniciar el cultivo a partir de las alícuotas almacenadas
Almohadilla de soporte para tubos centrífugos de gran volumen	Corning	CLS431124	La almohadilla de soporte debe usarse con tubos centrífugos de gran volumen a menos que el rotor de la centrífuga tenga almohadillas adecuadas de fondo en V
Tubos centrífugos de gran volumen	Corning	CLS431123-6EA	Tubos centrífugos de 500 mL