Purificación de vectores de virus adenoasociados mediante cromatografía de afinidad

Resumen

Fuente: Rghei, A. D., et al. Producción de vectores de virus asociados a adenovirus en pilas de células para estudios preclínicos en modelos animales grandes. J. Vis. Exp. (2021)

El video demuestra la purificación de vectores virales adeno-asociados recombinantes (AAV) a partir de lisado crudo de hospedador utilizando una matriz de afinidad basada en heparina. Las partículas virales se unen a la heparina inmovilizada, mientras que las impurezas son eliminadas mediante lavados. Un tampón de alta salinidad libera los virus intactos, los cuales se recogen en fracciones enriquecidas. Estas fracciones se concentran mediante centrifugación con membrana y se lavan para recuperar las partículas residuales, produciendo vectores AAV purificados y de alto título.

Protocolo

1. Transfección con dos plásmidos de células HEK293 en pilas de células

1. Descongele un vial criogénico de células de riñón embrionario humano 293 (HEK293) en un baño de agua ajustado a 37 °C.
   NOTA: Precaliente el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) completo a 37 °C mientras las células se descongelan para evitar el choque por frío durante la siembra. Asegúrese de que las células tengan un número bajo de pasajes, idealmente inferior a 20, para garantizar un crecimiento óptimo y eficiencia de transfección. Asegúrese de que las células estén certificadas como libres de micoplasma.
2. Transfiera el contenido del vial criogénico gota a gota a un tubo cónico de 15 mL que contenga 10 mL de DMEM completo precalentado y centrifugue las células a 500 × g durante 5 min.
3. Aspire el medio y resuspenda las células HEK293 en 20 mL de DMEM completo precalentado. Siembre las células en una placa de 15 cm e incube a 37 °C con 5% de CO₂.
4. Divida las células de una placa de 15 cm en tres para sembrarlas en la cámara de cultivo celular.
   1. Cuando las células alcancen una confluencia del 80%, aspire el medio y lave suavemente la placa con 3 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para no alterar la monocapa. Luego, aspire el PBS y añada 3 mL de tripsina.
   2. Incube durante 2 min a 37 °C hasta que las células se desprendan de la placa, y luego neutralice la tripsina añadiendo 7 mL de DMEM completo a la placa.
   3. Recoja todo el medio y las células en un tubo de 15 mL y haga un pellet de células centrifugando a 500 × g durante 5 min.
   4. Aspire el sobrenadante del tubo de 15 mL y resuspenda el pellet celular en 3 mL de DMEM completo. Añada 1 mL a cada placa de 15 cm que contenga 20 mL de DMEM completo; agite suavemente las placas para distribuir las células de manera uniforme e incube a 37 °C con 5% de CO₂.
5. Cuando las células alcancen una confluencia del 80%, repita los pasos 1.4.1 y 1.4.2. Recoja el sobrenadante en tubos cónicos de 50 mL e invierta suavemente el tubo para asegurar que las células estén homogéneas.
6. Determine la densidad celular mezclando 10 µL de las muestras de células con 10 µL de azul de tripano y añadiendo la mezcla a una lámina de recuento celular para su análisis en el contador de células.
7. Mezcle 1 L de DMEM completo precalentado con la suspensión celular necesaria para sembrar la cámara de cultivo celular (área superficial de 6360 cm²) con 1 × 10⁴ células/cm². Vierta la mezcla celular en la cámara de cultivo y gire suavemente para distribuir uniformemente las células en cada monocapa (Figura 1) e incube a 37 °C con 5% de CO₂.
8. Además de la cámara de cultivo celular, siembre una placa de 15 cm con 1 × 10⁴ células/cm² como referencia para la confluencia.
9. Tras un incubación de aproximadamente 65 h, verifique la confluencia en la placa de referencia, que idealmente debe estar entre el 80% y 90%.
   NOTA: Precaliente el DMEM completo para añadirlo a la cámara de cultivo celular a 37 °C.
10. Prepare una mezcla de polietilenimina (PEI)/ADN en una relación de concentración de 3:1 (p/p).
    1. Prepare la mezcla de ADN en un tubo cónico de 50 mL añadiendo 475 µg de pTrangene y 1425 µg de pHelper a 40 mL de medio con suero reducido para crear una relación 3:1 de pHelper:pTrangene.
       NOTA: El calculador de la mezcla PEI/ADN puede encontrarse utilizando Tabla 1.

Transfección de la cámara de cultivo celular
Protocolo
1. Deje que el ADN, el OptiMEM y el PEI alcancen la temperatura ambiente antes de la transfección
2. Ingrese el número de pilas de células que se transfectarán (no se requiere exceso)
3. Asegúrese de que las concentraciones de ADN sean correctas, ya que esto modificará los volúmenes necesarios
Número de cámaras de cultivo celular		1
Concentración del plásmido del transgén		1	mg/mL
Concentración del plásmido pDGM6.2FF		1	mg/mL
		Cantidad por cámara de cultivo celular		Mezcla maestra de transfección
	OptiMEM	48.1	mL	48.1	mL
Relación 1:3 pTransgén:pHelper	pTransgén	475	µg	475	µL
	pHelper	1425	µg	1425	µL
4. Añada los volúmenes requeridos de OptiMEM y ADN plasmídico a un tubo cónico de 50 mL
5. Invierta 10 veces para mezclar
Relación 3:1 PEI:ADN	PEI Max	5.7	mL	5.7	mL
6. Añada la cantidad requerida de PEI al tubo de 50 mL que contiene el OptiMEM y el ADN plasmídico
7. Cierre inmediatamente el tubo de 50 mL y vortexee e inviértalo 3–5 veces para mezclar.
8. Configure un temporizador durante 10 min para que los complejos de PEI incuben
9. Transfiera las pilas de células que se transfectarán a la cabina de seguridad biológica (CSB)
10. Después de 10 min, vierta la mezcla de transfección en un puerto naranja.
11. Mezcle suavemente el líquido por toda la pila de células
12. Devuelva la pila de células transfectadas al incubador asegurando un volumen igual en cada capa
13. Recolecte la cámara de cultivo celular 72 h después

Tabla 1: Calculadora de transfección para cámara de cultivo celular. Hoja de trabajo interactiva para determinar la concentración correcta de pTransgene, pHelper y PEI para la transfección de la cámara de cultivo celular.

2. Añada 5,7 mL de PEI (1 g/L) al medio con suero reducido y a la mezcla de ADN gota a gota. Luego, agite brevemente en vórtex e incube durante 10 min a temperatura ambiente.
NOTA: Mientras el PEI/ADN incuba a temperatura ambiente, se volverá ligeramente turbio.

11. Tras 8 min de incubación con PEI/ADN, retire el medio del compartimento de cultivo celular.
    NOTA: Asegúrese de aflojar ambas tapas naranjas para mantener un flujo suave del medio y evitar el desprendimiento de las células.
12. Añada el PEI/ADN a 1 L de DMEM completo precalentado y vierta lentamente la mezcla en la entrada del compartimento de cultivo celular. Distribuya el líquido uniformemente en todas las filas (Figura 1) e incube durante 72 h a 37 °C, con 5% de CO₂.

2 Recolección del virus adeno-asociado (AAV) y lisis química de las células HEK293 transfectadas

1. Agite vigorosamente la cámara de cultivo celular para desprender las células hasta que el medio se vea turbio por las celdas desprendidas y viértalo en cuatro tubos de centrífuga de 500 mL.
2. Centrifugue los tubos a 18,000 × g durante 30 min a 4 °C para obtener un sedimento celular. Vierta el sobrenadante clarificado en una botella de 1 L de copoliéster de tereftalato de polietileno (PETG).
   NOTA: Si no se tiene acceso a una centrífuga de alta velocidad, centrifugue a 12,000 × g durante 40 min. A esta velocidad, los sedimentos celulares podrían no ser sólidos y se deslizarán al verter el sobrenadante.
3. Resuspenda los sedimentos celulares en tubos de centrífuga de 500 mL con 50 mL de tampón de lisis e incube durante 60 min a 37 °C.
4. Centrifugue los tubos a 18,000 × g durante 30 min, luego transfiera el sobrenadante a la misma botella de PETG de 1 L. Deseche los restos celulares sedimentados.
   NOTA: Purifique inmediatamente el sobrenadante clarificado y almacénelo a 4 °C durante un máximo de 72 h. Para almacenamiento a largo plazo, guárdelo a -80 °C. No almacene a -20 °C.

3 Purificación del vector AAV mediante cromatografía de afinidad por heparina

1. Retire el lisado crudo de -80 °C y déjelo descongelar a 4 °C durante la noche. Una vez descongelado, use un filtro de 0,22 µM para filtrar el lisado crudo.
2. Para pasivar el concentrador centrífugo, agregue 4 mL de tampón de pretratamiento para filtro a un concentrador centrífugo por cada columna de sepharosa de heparina que se vaya a utilizar. Pasive el concentrador centrífugo a temperatura ambiente durante 2-8 h. Configure la pasivación inmediatamente antes de los pasos de purificación.
3. Configure el tubo y la bomba (Figura 2).
   1. Coloque el tubo en una bomba peristáltica y pase 20 mL de NaOH 1 M. A continuación, pase 50 mL de agua de grado molecular y luego 50 mL de DMEM basal.
   2. Conecte la columna de sepharosa de heparina de 5 mL al tubo y pase 25 mL de DMEM basal para eliminar el conservante.
4. Pase 0,2 µM del lisado crudo filtrado a través de la columna a un flujo de 1-2 gotas/s.

NOTA: Asegúrese de no introducir burbujas ni permitir que la columna se seque, ya que esto comprometería la columna y evitaría la elución del AAV. Deseche la columna si se seca y utilice una columna nueva para el resto del lisado crudo.

5. Cargue toda la lisado crudo en la columna de heparina y utilice las siguientes soluciones para lavar la columna.
   1. Lave con 50 mL de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) 1× sin Mg²⁺ y Ca²⁺.
   2. Lave con 15 mL de N-Lauroilsarcosina al 0,5 % en HBSS sin Mg²⁺ y Ca²⁺.
   3. Lave con 50 mL de HBSS sin Mg²⁺ y Ca²⁺.
   4. Lave con 50 mL de HBSS con Mg²⁺ y Ca²⁺.
   5. Lave con 50 mL de NaCl 200 mM/HBSS con Mg²⁺ y Ca²⁺.
   6. Eluya 5 × 5 mL (25 mL en total) con NaCl 300 mM/HBSS con Mg²⁺ y Ca²⁺ y etiquete las eluciones como E1-E5 (cada elución es de 5 mL).
6. Concentración del virus utilizando un concentrador centrífugo
   1. Centrifugue el concentrador centrífugo que contiene el tampón de pretratamiento a 900 × g durante 2 min. Deseche el flujo pasante.
   2. Lave el filtro del concentrador centrífugo con 4 mL de HBSS con Mg²⁺ y Ca²⁺ y centrifugue a 1000 × g durante 2 min; deseche el flujo pasante.
   3. Añada la elución E2 al concentrador centrífugo. Centrifugue a 1000 × g durante 5 min y deseche el flujo pasante.
   4. Termine de añadir E2 y luego añada E3 al concentrador centrífugo y centrifugue a 1000 × g durante 5 min hasta que el virus concentrado sea aproximadamente 1 mL.
      NOTA: Evite centrifugar el vector hasta que el volumen esté por debajo del nivel del filtro. No concentre E1, E4 ni E5 en el concentrador centrífugo, ya que contienen muy poco o ningún vector y contienen contaminantes.
   5. Retire el virus concentrado del concentrador centrífugo utilizando una punta filtrada p200 y colóquelo en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL.
   6. Lave el concentrador centrífugo con 200 µL de HBSS con Mg²⁺ y Ca²⁺ para desprender cualquier AAV restante del filtro. Pipetee hacia arriba y hacia abajo vigorosamente varias veces (durante ~30 s) para desprender cualquier virus adherido a la membrana y colóquelo en el tubo de centrífuga de 1,5 mL junto con el resto del virus. Mezcle bien el tubo.
   7. Aliquote 5 µL para extracción de ADN y almacene el vector purificado a -80 °C.
7. Lave la columna con 25 mL de NaCl 2 M. Además, utilice 25 mL de Triton X-100 al 0,1 %, precalentado a 37 °C, para lavar la columna. A continuación, lave la columna con 50 mL de dH₂O estéril y luego lave con 25 mL de etanol al 20 %.
8. Asegúrese de que la membrana de la columna esté completamente saturada en etanol al 20 %, ya que esta es la solución de almacenamiento. Selle la columna con los tapones proporcionados y almacénela a 4 °C.
9. Almacene el tubo en NaOH 1 M.
   NOTA: Si se limpia adecuadamente, las columnas de sefarosa de heparina pueden reutilizarse hasta cinco veces.

Resultados

Figura 1: Manipulación del bloque de células para siembra y transfección celular. Para sembrar el bloque de células, comience retirando una de las tapas de ventilación y vierta 1 L de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) completo, previamente calentado, con la cantidad necesaria de células HEK293 (A). Distribuya uniformemente las células y el medio apretando ambas tapas de ventilación, reúna todo el medio en una esquina del bloque de células mediante una de las tapas y colóquela en dicha esquina (B), coloque el bloque de células de lado (C) y luego gírelo 90° (D) de forma que los puertos de ventilación queden hacia arriba (E). Baje suavemente el bloque de células a su posición horizontal normal y asegúrese de que todas las cámaras del bloque estén completamente cubiertas con medio (F). Al momento de transfectar, desenrosque ambas tapas de ventilación y vierta lentamente el medio usado en un recipiente estéril para desecho, con un flujo uniforme para no perturbar la monocapa de células (G).

Figura 2: Configuración de la bomba peristáltica para la purificación del virus asociado a adenovirus (AAV). Conduzca el tubo desde el lisado crudo, a través de la bomba peristáltica y hacia la columna de matriz de heparina.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro de 0,22 μm	Millipore Sigma	S2GPU05RE
Tripsina al 0,25%	Fisher Scientific	SM2001C
Apilado celular de 10 cámaras	Corning	3271
Botella de PETG de 1 L	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Placas de cultivo celular	Greiner bio-one	7000232	Placas de 15 cm
Tubo cónico para cultivo	Thermo Fisher Scientific	339650	Tubo cónico de 15 mL
Tubo cónico para cultivo	Fisher Scientific	14955240	Tubo cónico de 50 mL
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con D-glucosa 1000 mg/L, L-glutamina	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Etileno	Greenfield	P016EA95	Diluir alcohol etílico (95 % vol) al 20 % para la sección 3.7.4
Suero bovino fetal (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
Soluciones salinas equilibradas de Hank (HBSS) con Mg²⁺ y Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH302268.02
Soluciones salinas equilibradas de Hank (HBSS) sin Mg²⁺ y Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH30588.02
Células HEK293	Colección Americana de Cultivos Celulares	CRL-1573	Al recibir las células, descongélelas y cultívelas según se describe en el protocolo del fabricante. Una vez que las células hayan sido pasadas mínimamente y crezcan bien, congele una subfracción en alícuotas para uso futuro y almacénela en nitrógeno líquido. Utilice siempre células con un número de pase inferior a 30. Si las células cultivadas han sido pasadas más de 30 veces, se recomienda reiniciar el cultivo a partir de las alícuotas almacenadas
Columna de sulfato de heparina	Cytiva Life Sciences	17040703
Almohadilla de soporte para tubos centrífugos de gran volumen	Corning	CLS431124	La almohadilla de soporte debe usarse con tubos centrífugos de gran volumen a menos que el rotor de la centrífuga tenga almohadillas V-bottom adecuadas
Tubos centrífugos de gran volumen	Corning	CLS431123-6EA	Tubos centrífugos de 500 mL
Tubo microcentrífugo	Fisher Scientific	05-408-129	Tubo microcentrífugo de 1,5 mL, esterilizar antes de usar
Agua de grado molecular	Cytiva Life Sciences	SH30538.03
Sal sódica del N-lauroilsarcosina	Sigma Aldrich	L5125	PRECAUCIÓN. Usar guantes
NaCl	Thermo Fisher Scientific	BP35810
Optimem, medio con suero reducido	Thermo Fisher Scientific	31985070
Pipetas de Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D	Esterilizar antes de usar
Solución salina tamponada con fosfato (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Diluir a 1x para su uso en células
Solución de penicilina-estreptomicina	Cytiva Life Sciences	SV30010
Plásmido pHelper	Diseño de novo o obtenido de un repositorio de plásmidos	NA
Bandeja para pipetas	Thermo Fisher Scientific	13-681-502	Adquirir bandejas estériles para pipetas
Éter de polietilenglicol tert-octilfenílico (Triton X-100)	Thermo Fisher Scientific	9002-93-1	PRECAUCIÓN. Usar guantes
Polietilenimina (PEI)	Polyscience	24765-1	Seguir las instrucciones del fabricante para preparar una solución de 1 L. Filtrar con filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 °C
Plásmido pTrangene	Diseño de novo o obtenido de un repositorio de plásmidos	NA	Debe contener el poliA del SV40 en el genoma para ser compatible con la titulación de AAV en la sección 5.0
Tubo de bomba	Cole-Parmer	RK-96440-14	Optimizar la longitud del tubo y la contención del virus en las fracciones E1-E5
Hidróxido de sodio (NaOH)	Thermo Fisher Scientific	SS266-4
Azul de tripano	Bio-Rad	1450021