Transducción de embriones fertilizados de rata mediante vectores lentivirales

Resumen

Fuente: Koza, P., et al. Generación de Ratones Transgénicos utilizando un Enfoque con Vector Lentiviral. J. Vis. Exp. (2020)

Este video demuestra la administración asistida por microinyección de vectores lentivirales en embriones de rata fertilizados para lograr la integración estable de transgenes en la generación de ratas transgénicas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras animales han sido revisados y aprobados por el comité de ética animal correspondiente.

1. Microinyección de vectores lentivirales en embriones de una sola célula bajo la zona pelúcida
   NOTA: Utilice embriones de una sola célula con dos pronúcleos visibles para la microinyección (Figura 1).
   1. Deshiele el alícuota del lentivirus (LV) a temperatura ambiente y centrifugue a 10.000 x g y temperatura ambiente (TA) durante 2 min para sedimentar cualquier resto celular residual.
   2. Configuración para microinyección
      1. Prepare pipetas de sujeción de vidrio (capilar de vidrio borosilicato) utilizando un microforjador. Tire del capilar de vidrio sobre una llama para producir una punta de 5–10 cm. Rompa la pipeta dejando una punta de ~4 cm. El diámetro exterior debe ser de ~80–120 µm.
         NOTA: Asegúrese de que la punta de la pipeta sea perfectamente recta y lisa.
      2. Monte la pipeta estirada en un microforjador con la punta frente al filamento calefactor. Caliente el filamento muy cerca de la punta de la pipeta y permita que se contraiga hasta un diámetro de ~15 µm (aproximadamente el 20 % del tamaño del embrión). Coloque la pipeta perpendicularmente al filamento calefactor, a 2–3 mm de la punta de la pipeta, y comience a calentar. El vidrio se ablandará. Caliente hasta que alcance un ángulo de 15°.
      3. Prepare capilares de vidrio borosilicato para microinyección con un filamento utilizando un estirador de pipetas. Inserte el capilar en la cámara de estiramiento. Realice una prueba de rampa (la primera vez con vidrio nuevo y cada vez después de cambiar el filamento). Ajuste el valor de Calor a rampa menos 10, Tirón a 100, Velocidad a 150 y Tiempo a 100.
         NOTA: Modifique los parámetros para obtener una pipeta de inyección óptima.
      4. Bajo una campana de flujo laminar de seguridad biológica, cargue aproximadamente 2 µL de la solución vírica en la pipeta de microinyección con una punta microloader.
      5. Prepare un plato para microinyección (tapa de placa de Petri de 60 mm) con una gota de 100 µL de medio M2 (en el centro), cubierta con parafina líquida o aceite mineral.
      6. Monte la pipeta de sujeción y el capilar de microinyección cargado con la solución vírica en un micromanipulador y el plato de microinyección bajo un microscopio invertido.
   3. Realice la microinyección
      1. Transfiera 15–20 embriones de una sola célula a la gota de medio M2 en el plato de microinyección. Sujete el embrión utilizando una pipeta de sujeción.
      2. Utilizando un aumento de 400x, inyecte la solución LV bajo la zona pelúcida hacia el espacio perivitelino utilizando el capilar de vidrio conectado a un inyector automático. Mantenga la pipeta bajo la zona pelúcida durante un momento.
         NOTA: Mediante una presión positiva suave, la solución vírica fluirá continuamente fuera de la pipeta de inyección, pero no se puede controlar el volumen de suspensión administrado.
      3. Utilizando una pipeta fina, devuelva los embriones al plato de cultivo en el incubador a 37 °C en una atmósfera de 5% CO₂ . El número de inyecciones de un cigoto puede variar y puede adaptarse según la concentración del vector vírico.
         NOTA: Los embriones inyectados pueden transferirse a madres portadoras en la etapa de una célula o incubarse durante la noche (O/N) en medio M16 antes de transferirlos en la etapa de dos células. Debe evitarse el cultivo prolongado in vitro de embriones de rata.

Resultados

Figura 1. Fotografía microscópica de un embrión de rata en estadio de una sola célula que fue preparado para la inyección subzonal de un vector lentiviral. El embrión fue inmovilizado con una pipeta de sujeción. Son visibles los dos pronúcleos que contienen el material genético materno y paterno, así como el cuerpo polar. Barra de escala = 20 μm.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Conjuntos de tubos de aspiración para pipetas microcapilares calibradas	Sigma	A5177-5EA
Capilares de vidrio borosilicato con filamento GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	Capilar de inyección
Placa de cultivo celular CELLSTAR de 35 mm	Greiner Bio-One	627160
Placa de cultivo celular CELLSTAR de 60 mm	Greiner Bio-One	628160
Aceite mineral	Sigma	M8410-500ML
Microscopio invertido	Zeiss	Axiovert 200
Medio M2	Sigma	M7167
VacuTip	Eppendorf	5175108	Portacapilar
Medio M16 EmbryoMax	Sigma	MR-016-D