Purificación de la integrasa viral mediante cromatografía de afinidad

Resumen

Fuente: Lopez Jr., M. A., et al. Detección y eliminación de la contaminación por nucleasas durante la purificación de la integrasa recombinante del virus espumoso prototípico. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra la purificación de la integrasa viral marcada con polihistidina mediante cromatografía de afinidad al níquel. El protocolo utiliza una elución con gradiente de imidazol para aislar selectivamente la integrasa según su afinidad por la resina cargada con níquel.

Protocolo

1. Cromatografía de afinidad por níquel

1. Descongele un pellet bacteriano sobre hielo.
   NOTA: Esto tomará un tiempo considerable (aproximadamente 2 - 3 h). Cuando el pellet se haya descongelado hasta formar una suspensión celular, agregue adicionalmente 500 μM de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) (solución stock de 100 mM).
2. Mantenga el tubo de 50 mL con la suspensión bacteriana sobre hielo. Someta las bacterias a sonicación con una amplitud del 30% durante 30 s (1 s encendido, 1 s apagado) por cada pellet derivado de 1 L de cultivo, utilizando un sonicador con una punta biológica de 0,5 pulgadas de diámetro y una micro-punta cónica de 0,125 pulgadas de diámetro, una frecuencia de 20 kHz y una potencia máxima de 400 W.
3. Transfiera la muestra celular a un tubo de ultracentrífuga frío. Utilice ensamblajes de botellas de policarbonato (25 mm de diámetro, 89 mm de altura) compatibles con un rotor fijo tipo 60 Ti. Se pueden usar tubos y rotores alternativos si se logra la misma fuerza gravitacional. Centrifugue a 120.000 x g durante 60 min a 4 °C. Debe observarse un pellet evidente. El sobrenadante puede tener un color amarillento.
4. Transfiera el sobrenadante vertiendo o pipeteando a un tubo cónico de 50 mL frío. Anote el volumen; este volumen debe ser aproximadamente igual al del tampón de resuspensión utilizado antes de la congelación rápida. Si el sobrenadante es viscoso, podría estar contaminado con ADN bacteriano, lo cual podría obstruir la columna de cromatografía. En ese caso, repita la ultracentrifugación para sedimentar el ADN bacteriano.
5. Prepare 500 mL del tampón A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) y 500 mL del tampón B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM imidazol).
   NOTA: En este protocolo, mantenga el sistema de cromatografía líquida de proteínas de alta resolución (FPLC), todos los tampones y la muestra a 4 °C en una cámara fría.
   1. Filtre estérilmente los tampones A y B con unidades de filtro desechables de 0,2 μm. Dependiendo del sistema FPLC, lave la bomba A y la bomba B con el tampón A y el tampón B, respectivamente. Haga pasar a través del sistema 90% del tampón A y 10% del tampón B hasta que las lecturas de conductividad y de ultravioleta (UV) se estabilicen. La velocidad de flujo máxima dependerá del instrumento; utilice una velocidad de flujo de 5 mL/min con un límite máximo de presión de 1,0 MPa.
6. Prepare una columna FPLC de 110 mm de largo y 5 mm de diámetro con 1,5 mL de resina cargada con níquel (capacidad máxima de unión 50 mg/mL, presión máxima 1 MPa). La columna puede prepararse el día anterior a la purificación y almacenarse a 4 ˚C.
7. Conecte la columna al instrumento FPLC. Equilibre la columna con 20 mL de 90% del tampón A y 10% del tampón B (20 mM imidazol) a una velocidad de flujo de 0,5 mL/min con un límite máximo de presión de 0,5 MPa. El instrumento debe estar registrando en tiempo real los datos de conductividad y absorbancia UV a 280 nm (A₂₈₀). Las lecturas de conductividad y UV deben estabilizarse. Si estas lecturas no se han estabilizado, continúe haciendo pasar los tampones a través de la columna hasta que se estabilicen.
8. Cargue la muestra proteica (~10 mL por pellet) en la columna a una velocidad de flujo de 0,15 mL/min con un límite máximo de presión de 0,5 MPa. La velocidad de flujo y la presión de la columna permanecen constantes durante toda la purificación. Recoja el flujo de paso a través en un tubo de 50 mL.
   1. Lave la columna con 20 mL de 90% del tampón A y 10% del tampón B. Recoja el lavado en un tubo de 50 mL. Eluya las proteínas con un gradiente lineal de 20 mL desde 10% hasta 100% del tampón B (20 mM a 200 mM imidazol).
   2. Finalmente, lave la columna con 5 mL de tampón B al 100% (200 mM imidazol). Recoja el gradiente y el lavado final en fracciones de 0,27 mL.
9. Combine 15 μL de tampón de muestra 2x SDS-PAGE con 15 μL de las fracciones de flujo de paso, lavado y pico de A₂₈₀. Hierva las muestras durante 3 min.
   1. Prepare dos geles de SDS-PAGE al 10%. Cargue 10 μL de cada muestra en los geles y 4 μL de estándares proteicos precargados. Ejecute, tiña y analice los geles.
   2. Combine las fracciones que parezcan contener integrasa del virus espumoso prototípico (PFV IN) casi pura según la inspección visual. Mida el volumen mediante pipeteo, típicamente 8 - 10 mL.
   3. Utilizando un espectrofotómetro, mida la A₂₈₀ de las fracciones combinadas y calcule la cantidad total de proteína PFV IN; el rendimiento típico es de ~10 mg por litro de cultivo inducido. El coeficiente de extinción de PFV IN con la etiqueta hexahistidina es 59360 cm^-1 M^-1.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
Imidazol	Sigma-Aldrich	I0250
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430