Purificación de la integrasa viral mediante cromatografía de afinidad por heparina

Resumen

Fuente: Lopez Jr., M. et al. Detección y eliminación de la contaminación por nucleasas durante la purificación de la integrasa recombinante del virus espumoso prototípico. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra el procedimiento para purificar la integrasa viral a partir de contaminación con nuclesas bacterianas utilizando cromatografía en columna de heparina Sepharosa seguida de análisis por SDS-PAGE para confirmar la pureza de la proteína.

Protocolo

1. Cromatografía de afinidad por heparina
   1. Prepare 250 mL del tampón C (50 mM clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano (Tris-HCl), pH 7,5, 10 mM ditiotreitol (DTT), 0,1 mM ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 500 μM fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)) y 250 mL del tampón D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
      NOTA: En este protocolo, el sistema de cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC), los tampones y la muestra se mantienen en una cámara fría a 4 ˚C.
      1. Filtre estérilmente los tampones C y D con unidades de filtro desechables de 0,2 μm. Según el sistema FPLC, lave la bomba A y la bomba B con el tampón C y el tampón D, respectivamente. Pase 80 % del tampón C y 20 % del tampón D a través del sistema hasta que las lecturas de conductividad y de ultravioleta (UV) se estabilicen. La velocidad de flujo máxima dependerá del instrumento; habitualmente utilizamos una velocidad de flujo de 5 mL/min con un límite máximo de presión de 1,0 MPa.
   2. Prepare una columna FPLC de 80 mm de largo y 5 mm de diámetro con 1 mL de resina de heparina Sepharose (capacidad máxima de unión de 2,0 mg de antitrombina III bovina por mL de resina; presión máxima 1,4 MPa). La columna puede prepararse el día anterior a la purificación y almacenarse a 4 °C. Conecte la columna al instrumento FPLC.
      1. Equilibre la columna con 20 mL de 80 % del tampón C y 20 % del tampón D (200 mM NaCl) a una velocidad de flujo de 0,5 mL/min con un límite máximo de presión de 1 MPa. El instrumento debe recopilar datos en tiempo real sobre conductividad y absorbancia UV a 280 nm (A₂₈₀). Las lecturas de conductividad y UV deben estabilizarse. Si estas lecturas no se han estabilizado, continúe pasando los tampones a través de la columna hasta que se estabilicen.
   3. Reduzca la concentración de NaCl de la muestra de integrasa del virus espumoso prototípico (PFV IN) a 200 mM añadiendo 1,5 volúmenes del tampón C. Por ejemplo, añada 15 mL del tampón C a 10 mL de PFV IN. Nuestro volumen total es típicamente de ~25 mL.
   4. Cargue la muestra diluida de PFV IN en la columna de heparina Sepharose a una velocidad de flujo de 0,5 mL/min con un límite máximo de presión de 1,0 MPa. La velocidad de flujo y la presión de la columna permanecen iguales durante toda la purificación. Recoja el flujo directo en un tubo cónico de 50 mL.
      1. Lave la columna con 20 mL de 80 % del tampón C y 20 % del tampón D (200 mM NaCl), recolectando el lavado en un tubo cónico de 50 mL. Eluya la columna con un gradiente lineal de 30 mL de 20 % a 100 % del tampón D (200 mM a 1 M NaCl).
      2. Lave la columna con 5 mL de 100 % del tampón D. Recoja el gradiente y el lavado final en fracciones de 0,37 mL.
   5. Analice la carga, el flujo directo, el lavado y las fracciones mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico al 8 % (SDS-PAGE). La PFV IN, tras la escisión de la etiqueta hexahistidina, tiene un peso molecular de 44.394 Da, y el coeficiente de extinción permanece en 59.360 cm^-1 M^-1 sin la etiqueta hexahistidina. Almacene todas las fracciones a 4 ˚C hasta la finalización de un ensayo de nucleasa.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
IPTG (Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido)	Denville Scientific	CI8280
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
PMSF (Fluoruro de fenilmetanosulfonilo)	Amresco	754
DTT (Ditiotreitol)	P212121	SV-DTT
EDTA UltraPure	Invitrogen/Gibco	15575
Heparina Sepharosa 6 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0998-01