Este video describe el ensayo de placas virales utilizando partículas de pseudovirus de coronavirus. El pseudovirus diluido se añade a una monocapa de células de mamífero, seguido de incubación con una cobertura de metilcelulosa. Las placas formadas por células infectadas se cuentan visualmente para determinar la titulación del virus infeccioso.
Artículo de método
Cuantificación de partículas de pseudovirus mediante ensayo de placa
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30 de septiembre de 2026
En este artículo
Resumen
Protocolo
Titulación del virus de la estomatitis vesicular que expresa la proteína espiga del coronavirus y la proteína verde fluorescente mejorada (pseudovirus VSV-S-eGFP)
1. Dilución seriada para determinar la titulación viral
1. Siembre células Vero E6 en placas de 6 pocillos con una densidad de siembra de 6 × 105 células por pocillo en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco o DMEM (con 10 % de FBS (suero bovino fetal)), e incube durante la noche a 37 °C con 5 % de CO₂.
NOTA: También se pueden utilizar células Vero que sobreexpresan TMPRSS2 y hACE2.
2. Prepare una serie de diluciones seriadas 10 veces del virus VSV-SeGFP en DMEM frío sin suero colocando 900 μL de medio en siete tubos de microcentrifugado. Etiquete los tubos del 1 al 7. Añada 100 μL del stock vírico al primer tubo y mezcle brevemente mediante vortex. Transfiera 100 μL del virus diluido del tubo 1 al tubo 2 y mezcle brevemente mediante vortex; continúe hasta el tubo 7.
3. Aspire el medio de todos los pocillos de la placa de 6 pocillos que contiene células Vero E6 y sustitúyalo con 500 μL de las diluciones 105 a 107. Incube las placas durante 45 min a 37 °C con 5 % de CO₂, agitando suavemente cada 15 min.
Aspire el inóculo y sustitúyalo por una capa superior que contenga una mezcla 1:1 de DMEM 2x y carboximetilcelulosa (CMC) al 6%, con una concentración final de CMC al 3%, suplementada con 10% de suero bovino fetal (FBS); incube a 34 °C con 5% de CO₂ durante 48 h.
NOTA: Precalentar la mezcla de recubrimiento en un baño de agua a 37 °C durante 15 min durante el paso de infección. Se puede usar una mezcla 1:1 de agarosa al 1% con DMEM 2x suplementado con 10% de FBS en lugar de CMC. Para recubrir con agarosa, hervir agarosa al 1% (en dH₂O) y mezclar con DMEM 2x frío. Asegurarse de que la mezcla tenga una temperatura adecuada antes de añadirla a la monocapa celular (aproximadamente 37-40 °C). Si se utiliza agarosa para el recubrimiento, las células deben fijarse incubando en 2 mL de metanol:ácido acético en proporción 3:1 durante al menos una hora antes de la tinción.
2. Tinción y cálculo del título viral
1. Visualice las placas tiñéndolas con violeta de cristal o mediante la visualización directa de eGFP con un microscopio fluorescente.
2. Para teñir las placas, aspire la capa superior, lave una vez con PBS y luego agregue 2 mL de violeta de cristal al 0,1 % (en metanol al 80 % y dH₂O) a cada pocillo. Coloque en un agitador orbital durante aproximadamente 20 min a temperatura ambiente antes de la descoloración. Retire el violeta de cristal y lave suavemente cada pocillo dos veces usando dH₂O o PBS.
NOTA: Los pasos de lavado y tinción deben realizarse suavemente pipeteando lentamente hacia el lado de cada pocillo para asegurar que la monocapa celular permanezca intacta durante todo el procedimiento.
3. Deje secar las placas durante al menos 1 h antes de contar las placas. Asegúrese de obtener los recuentos de placas a partir de pozos que contengan entre 20 y 200 placas. Para calcular la titulación del virus en unidades formadoras de placas (PFU) por mL, multiplique el factor de dilución del pozo contado por el volumen de infección, y divida este número entre el número de placas presentes en el pozo respectivo.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| tripsina-EDTA al 0,25% (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| células Vero E6 | ATCC | CRL-1586 | |
| celulosa carboximetílica | Sigma | C5678 | |
| medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| medio de Eagle modificado por Dulbecco (polvo) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| penicilina/estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| anticuerpo neutralizante contra la proteína Spike del SARS-CoV-2 (2019-nCoV), Mab de ratón | SinoBiological | 40592-MM57 |
