Neutralización mediada por anticuerpos de pseudovirus que expresan la proteína Spike del coronavirus utilizando suero de pacientes

Resumen

Fuente: Jamieson, T. R., et al. Detección de anticuerpos neutralizantes de SARS-CoV-2 mediante imágenes fluorescentes de alto rendimiento de la infección por pseudovirus. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra la neutralización mediada por anticuerpos de pseudovirus que portan proteínas de espiga de coronavirus utilizando suero de pacientes, estudiada mediante imágenes fluorescentes de alto rendimiento de monocapas de células epiteliales infectadas.

Protocolo

Todos los procedimientos que implican la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del comité de ética institucional (IRB).

1. Diluciones de anticuerpos o suero e infecciones

NOTA: Este protocolo puede aplicarse para medir la neutralización del virus de la estomatitis vesicular que expresa la proteína de la espiga del coronavirus y la proteína verde fluorescente mejorada (pseudovirus VSV-S-eGFP) por anticuerpos disponibles comercialmente y suero de pacientes, así como suero recolectado de animales para estudios preclínicos de desarrollo de vacunas.

1. Serie de diluciones seriadas
   1. Antes de diluir las muestras de suero, inactivar cada muestra mediante calor en un baño de agua a 56 °C durante 30 min para inactivar el complemento. Asegurarse de tomar las precauciones de seguridad necesarias al manipular muestras de pacientes; abrir los recipientes de muestras únicamente dentro de la cabina de cultivo de tejidos y usar equipo de protección personal adecuado para el nivel de contención 2.
   2. Preparar la serie de diluciones en una placa de 96 pocillos vacía (Placa 1).
   3. Iniciar todas las diluciones en la fila A de la placa de 96 pocillos con un volumen de 80 µL. *Para muestras de pacientes, comenzar la serie de diluciones en una proporción de 1 a 10 colocando 8 µL de suero en 72 µL de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) sin suero (con 1 % de penicilina/estreptomicina).
      NOTA: La concentración del anticuerpo neutralizante utilizada dependerá de la actividad predicha por el fabricante. Para el anticuerpo neutralizante frente a la proteína Spike de SARS-CoV-2 utilizado aquí (véase la Tabla de materiales), comenzar con 5 µg/mL para observar al menos un 50 % de neutralización.
   4. Añadir 40 µL de DMEM sin suero (con 1 % de penicilina/estreptomicina) a las filas B a G, y 80 µL a la fila H. No añadir virus a la fila H, ya que sirve como control solo de células.
   5. Utilizando una pipeta multicanal de 12 canales, mezclar y transferir 40 µL de suero o anticuerpo diluido de la fila A a la fila B. Mezclar y repetir hasta la fila F, descartando 40 µL de la fila F. No añadir suero a la fila G, ya que representa la fila de control solo de virus.
2. Infección y recubrimiento
   1. Preparar un volumen adecuado de VSV-S-eGFP diluido para tratar cada pocillo a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,05 (o 2000 unidades formadoras de placas (pfu)). (Al realizar este cálculo, tener en cuenta que solo se transferirán 60 µL del volumen total de 80 µL a las células; por lo tanto, asegurarse de multiplicar el volumen del virus por 1,33 para mantener 2000 pfu).
      NOTA: Dado que VSV-S-eGFP es sensible a la temperatura, asegurarse de mantener los stocks víricos sobre hielo cuando no estén en uso y evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación, ya que los títulos variarán tras congelaciones repetidas.
   2. Añadir 40 µL de virus diluido a cada pocillo de las filas A a G de la Placa 1 y mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 4 a 5 veces. Incubar la placa durante 1 h a 37 °C con 5 % de CO₂.
   3. Retirar la placa que contiene las células del incubador (Placa 2) y aspirar cuidadosamente el medio de todos los pocillos. Transferir 60 µL de la mezcla de anticuerpo/virus de la Placa 1 a la Placa 2 e incubar durante 1 h a 37 °C con 5 % de CO₂, agitando suavemente la placa cada 20 min.
   4. Completar cada pocillo con 140 µL de recubrimiento que contenga carboximetilcelulosa (CMC) en DMEM para obtener una concentración final de 3 % de CMC (con 10 % de FBS (suero bovino fetal) y 1 % de penicilina/estreptomicina). Colocar la Placa 2 en un incubador ajustado a 34 °C con 5 % de CO₂ durante aproximadamente 24 h antes de la obtención de imágenes.
      NOTA: Precalentar la mezcla de recubrimiento en un baño de agua a 37 °C durante 15 min durante el paso de infección.

2. Imagen y cuantificación (Día 3)

1. Imaginar las placas utilizando un lector de fluorescencia automatizado (con un filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) o un filtro alternativo con una longitud de onda de excitación de 488 nm). Cuantificar la infección viral creando un protocolo que identifique y cuente automáticamente los focos individuales de eGFP (proteína verde fluorescente mejorada). Si no hay disponible una función de conteo automático, utilizar el software ImageJ para cuantificar el número de focos de eGFP.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Carboximetil celulosa	Sigma	C5678
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco)	Fisher scientific	10-013-CV
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (Polvo) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12-800-017
Células Vero E6	ATCC	CRL-1586
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)	Fisher scientific	21-031-CV