Monitoreo de la expresión génica específica de etapa en el virus Vaccinia mediante reporteros fluorescentes

Resumen

Fuente: Rozelle, D. K., et al. Virus Repórter de Vaccinia para Cuantificar la Función Viral en Todas las Etapas de la Expresión Génica. J. Vis. Exp. (2014)

Este video demuestra un método para monitorear la replicación del virus vaccinia utilizando reporteros fluorescentes regulados por promotores específicos de cada etapa. La expresión secuencial de proteínas fluorescentes verde, roja y azul marca las fases temprana, intermedia y tardía de la infección, permitiendo el análisis de alto rendimiento de la expresión génica viral específica de cada etapa.

Protocolo

1. Sembrar células

1. Disociar las células HeLa de la placa y diluirlas en medio de crecimiento (medio de Eagle modificado por Dulbecco [DMEM], 2 mM L-glut, 10 % de suero bovino fetal [FBS]) hasta aproximadamente 2,0 x 10⁵ células/ml. Distribuir 100 μl por pocillo en una placa de 96 pocillos con paredes negras y fondo transparente y plano (20 000 células por pocillo).
2. Incubar las células durante 24 horas hasta alcanzar confluencia en un incubador a 37 °C + 5 % de CO₂.

2. Infectar células

1. Diluya los virus e infecte las células.
   1. Deshiele el virus fluorescente TrpV (virus triple; Venus temprano, mCherry intermedio, TagBFP tardío) y PLV (Venus sin promotor) y desagregue mediante sonicación durante 5 minutos. Alternativamente, los lotes crudos de virus pueden mezclarse 1:1 con tripsina 0,25 mg/ml en medio de infección e incubarse a 37 °C durante 30 min.
   2. Diluya los lotes crudos de virus en medio de infección a 37 °C (DMEM, 2 mM L-glut, 2% SFB). Para infecciones con alta MOI (10 PFU/célula), diluya el lote de virus a 1,0 x 10⁷ PFU/ml, suponiendo 5 x 10⁴ células/pocillo y un volumen de inóculo de 50 μl. Planifique infectar 3 pocillos replicados para cada tratamiento con TrpV y otros 3 pocillos replicados para el mismo tratamiento con PLV, para tener en cuenta la fluorescencia de fondo específica de cada tratamiento.
   3. Infecte los pocillos añadiendo 50 μl/pocillo de virus diluido en medio de infección. Esto se define como tiempo = 0 hr post-infección (0 hpi).
2. Incube de 6 a 24 hr en un incubador a 37 °C + 5% CO₂.

3. Fijar células

1. Fije las células añadiendo 100 μl de paraformaldehído al 8% al medio de infección ya presente en cada pocillo. Incube a temperatura ambiente durante 15 min protegido de la luz.
   NOTA: Se recomienda añadir paraformaldehído 2x (8%) directamente al medio de infección para prevenir la aerosolización de vaccinia infecciosa, que puede ocurrir si el medio de alto título se invierte directamente en el recipiente de desecho antes de la fijación.
2. Elimine el fijador invirtiendo la placa en el recipiente de desecho.
3. Añada 100 μl de solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente.
4. Selle la placa con una película adhesiva ópticamente transparente.
   NOTA: Las placas pueden almacenarse a 4 °C si no se van a leer inmediatamente. Asegúrese de devolver las placas selladas a temperatura ambiente antes de la lectura para evitar que la condensación distorsione las mediciones del espectrofotómetro.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM)	Gibco	11995-065
Suero Bovino Fetal - Optima, Inactivado por Calor (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
L-Glutamina 200 mM (L-glut)	Gibco	25030-081
Microplacas de 96 pocillos, fondo claro plano, negro, de poliestireno tratado para cultivo celular (TC)	Corning	3603
Solución Salina Tamponada con Fosfatos (PBS)	Gibco	10010-023
Película ópticamente clara TempPlate RT	USA Scientific	2978-2700
Medio Opti-MEM con Bajo Contenido de Suero	Gibco	31985-070