Aislamiento y purificación de virus a partir de cuerpos de insectos infectados

Resumen

Fuente: Biesbrock, A. M. et al. Propagación del Homalodisca coagulata virus-01 mediante cultivo celular de Homalodisca vitripennis. J. Vis. Exp. (2014)

Este video demuestra la propagación in vitro del Homalodisca coagulata Virus-01 utilizando células huésped derivadas de insectos. Describe los pasos para la purificación del virus, la inoculación y la replicación dentro de células de insecto en cultivo.

Protocolo

1. Extracción de Virus Completo

1. Homogenice cuerpos completos de H. vitripennis positivos para el virus en tampón fosfato, pH ~7.2, con 0,02 % de dietiilditiocarbamato de sodio trihidratado (DETCA) mediante vortex durante intervalos de ~10 segundos hasta que no queden grandes grumos de tejido. Extraiga el virus mediante centrifugación ultrarrápida a 124.500 x g durante 4 horas a 4 °C o a 22.000 x g durante 16 horas a 4 °C. Si se forma un precipitado en la parte superior, retírelo con un hisopo estéril.
2. Deseche el sobrenadante.
3. Recupere el precipitado y disuélvalo con 5 ml de tampón fosfato 10 mM (sin DETCA), pH ~7,2, que contenga 0,4 % de ácido Na-deoxicólico y 4 % de éter de polietilenglicol hexadecílico (Brij 52).
   1. Para mezclar bien el precipitado, retírelo de la pared del tubo y tritúrelo hasta que esté en solución, si es necesario.
   2. Agregue más tampón fosfato 10 mM en incrementos de ~5 ml para ayudar a que el precipitado pase a solución si es necesario, y combínelo en 2 tubos.
4. Centrifugue la solución a 300 x g durante 15 minutos.
5. Retire el sobrenadante y pase la solución a través de un filtro de 0,45 μm, y recoja el filtrado en un tubo colector grande.
6. Transfiera el filtrado a una membrana de diálisis con un corte de peso molecular (MWCO) de 3,5 kD, utilizando pequeñas cantidades de tampón fosfato 10 mM (pH 7) sin DETCA si es necesario.
7. Coloque la membrana de diálisis en un vaso de precipitados grande lleno con ddH₂O a 4 °C. Cambie el ddH₂O cada hora durante 5-6 horas, hasta que se forme un precipitado blanco en la membrana.
8. Recupere el virus purificado desde el interior de la membrana y someta la solución de virus al 100 % a una serie de diluciones de 10 veces agregando 10 μl de solución a 90 μl de ddH₂O. Posteriormente, agregue 10 μl de la dilución a otros 90 μl de ddH₂O hasta alcanzar una dilución de 1:100.000.
9. Almacene la solución del virus a -80 °C.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Frascos de cultivo celular Corning	Sigma Aldrich	CLS430168	Área de superficie 25 cm², cuello inclinado, tapón (sello tipo tapón)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		Microscopio invertido y cámara
Placas de cultivo multipocillo Greiner CELLSTAR	Sigma Aldrich	M8937	48 pocillos (tratados para cultivo celular, con tapa)
DETCA	Sigma Aldrich	228680	Clorhidrato de sodio dietilditiocarbamato trihidratado
Sistema de filtro de vacío con botella Corning	Sigma Aldrich	CLS431206	Membrana de acetato de celulosa, tamaño de poro 0,45 μm, área de membrana 54,5 cm², capacidad de filtrado 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	Éter de polietilenglicol hexadecílico
Solución tampón fosfato	Sigma Aldrich	P5244	Recibida como 100 mM, diluida a 10 mM con agua estéril
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Solución salina tamponada con fosfato
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Medio para insectos de Grace (suplementado, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	Componente del medio H2G+ para cicadélidos
L-histidina monohidrato	Sigma Aldrich	H8125	Componente del medio H2G+ para cicadélidos
Medio 199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	Componente del medio H2G+ para cicadélidos
Medio 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	Componente del medio H2G+ para cicadélidos
Salinos equilibrados de Hank (1x)	Sigma Aldrich	51322C	Componente del medio H2G+ para cicadélidos
L-Glutamina (100x)	Sigma Aldrich	G3126	Componente del medio H2G+ para cicadélidos
MEM, mezcla de aminoácidos (50x)	Sigma Aldrich	56419C	Componente del medio H2G+ para cicadélidos
Solución de MgCl 1 M	Sigma Aldrich	M8266	Componente del medio H2G+ para cicadélidos
Pen-Strep	Sigma Aldrich	G6784	Componente del medio H2G+ para cicadélidos
Nistatina	Sigma Aldrich	N6261	Componente del medio H2G+ para cicadélidos
Gentamicina	Sigma Aldrich	46305	Componente del medio H2G+ para cicadélidos
Dextrosa	Sigma Aldrich	D9434	Componente del medio H2G+ para cicadélidos
Suero bovino fetal	Sigma Aldrich	F2442	Componente del medio H2G+ para cicadélidos