Generación de lentivirus recombinantes en células mamíferas

Resumen

Fuente: Zhang, Y., et al., Reprogramación Directa de Fibroblastos de Ratón en Melanocitos. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra la producción y concentración de lentivirus recombinante en células de mamífero, lo que permite una entrega eficiente de factores de transcripción u otros elementos genéticos para aplicaciones como la reprogramación celular, estudios funcionales e investigaciones terapéuticas potenciales.

Protocolo

1. Construcción de un sistema empaquetador de lentivirus concentrado para factores de transcripción

1. Producción del virus concentrado (Figura 1A, B)
   1. Plaquear 1,5 × 10⁶ Cultivar células HEK (riñón embrionario humano)-293T en una placa de 60 mm y mantener estas células en medio normal (véase Tabla 1) a 37 °C en un incubador humedecido con 5 % de CO₂₂.
      NOTA: Si el virus necesita empacarse por lotes, puede utilizarse una placa de cultivo celular de 100 mm (para más detalles, véase Tabla 2).
   2. Tras 24 h, asegúrese de que las células HEK-293T hayan alcanzado un 80-90% de confluencia el día de la transducción, y sustituya el medio por 3,5 mL de DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) (150 µL de DMEM por 1 cm²). Dejar las células a 37 °C en un incubador húmedo con 5 % de CO₂₂ durante 2 h.
      NOTA: El medio de reemplazo debe ser libre de suero, para que las células puedan ser "privadas de suero" para una mejor transfección de plásmidos.
   3. Preparar la mezcla de plásmidos (mezcla A) que contiene 3 µg de los plásmidos diana de Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 o Snai2; 1 µg del plásmido de empaquetamiento PMD2.G, y 2 µg del plásmido de empaquetamiento PSPAX2. Aforar el volumen de la mezcla A a 150 µL con DMEM sin suero. Prepare la mezcla del reactivo de transfección (mezcla B) añadiendo 12 µL del reactivo de transfección (el volumen es el doble de la masa total de todos los plásmidos) y aforar el volumen de la mezcla B hasta 150 µL con DMEM sin suero
      NOTA: Al preparar las mezclas, es importante añadir el líquido lentamente para evitar la formación de burbujas de aire.
   4. Combine la mezcla A y la mezcla B tras dejarlas reposar durante 5 min a temperatura ambiente. Incube la mezcla a temperatura ambiente durante 20-30 min para formar el complejo de transfección.
   5. Saque las células HEK-293T del incubador, reemplace el medio con DMEM + 2 % de FBS (suero bovino fetal), agregue la mezcla del paso 1.1.4 gota a gota y mezcle suavemente el líquido.
   6. Después de 8 h, cambie el medio por 3,5 mL de medio normal. Después de cambiar el medio, recoja el sobrenadante viral a las 24 h y a las 48 h.
   7. Mezcle los sobrenadantes virales recogidos en dos puntos temporales diferentes. Centrifugue a 200 × g durante 5 min a 4 °C. × g durante 5 min a 4 °C. Pase el sobrenadante a través de 0.45 µm filtros y recógelos en un tubo cónico estéril de 50 mL.
      NOTA: El virus recogido a las 24 h puede almacenarse a 4 °C y mezclar con el virus recogido a las 48 h.
   8. Concentre el sobrenadante viral mediante centrifugación a 6000 × g a 4 °C durante la noche (~16 h). Asegúrese de que el botón viral sea visible en el fondo del tubo cónico después de la centrifugación. × g a 4 °C durante la noche (~16 h). Asegúrese de que el botón vírico sea visible en el fondo del tubo cónico tras la centrifugación.
   9. Vierta lentamente el sobrenadante. Disuelva el botón vírico en un volumen de medio normal equivalente a 1/100^th del volumen del sobrenadante vírico. Utilizando una micropipeta P1000, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta obtener una mezcla homogénea. Divida el virus concentrado en tubos de microcentrifugado según sea necesario. Almacene a −80 °C.
      NOTA: El virus se concentra 100 veces con este método. El virus concentrado (100x) puede almacenarse durante >1 año a −80 °CEvite congelaciones y descongelaciones repetidas del virus.

Tabla 1: Componentes de los medios normales y de reprogramación.

	Componentes	Dosis (concentración, volumen)	Concentración final
Medio normal (100 mL)	DMEM/ALTA GLUCOSA	89 mL
	Suero bovino fetal inactivado por calor	10 mL
	Antibióticos (Pen/Estr)	10000 U/mL, 1 mL	100 U/mL
Medio de reprogramación (100 mL)	RPMI-1640	88 mL
	Suero bovino fetal inactivado por calor	10 mL
	SCF humano recombinante	200 μg/mL, 50 μL	100 ng/mL
	bFGF humano recombinante	4 μg/mL, 250 μL	10 ng/mL
	Insulina humana recombinante	10 mg/mL, 50 μL	5 μg/mL
	EDN3 humano	100 μM, 100 μL	0.1 μM
	Toxina de la cólera	0.3 mg/mL, 0.56 μL	20 pM
	Forbol 12-miristato 13-acetato (TPA)	1 mM, 20 μL	200 nM
	Hidrocortisona	100 μg/mL, 500 μL	0.5 μg/mL
	Adenina	40 mg/mL, 60 μL	24 μg/mL

Tabla 2: Detalles del sistema de empaquetamiento de lentivirus.

Placa de cultivo	Densidad de siembra (células/placa)	Medio (mL)	Sistema de plásmidos			Reactivo de transfección (µL)
			Plásmido diana (μg)	PMD2.G (μg)	PSPAX2 (μg)
35 mm	6 ×105	1.5	1.5	0.5	1	6
60 mm	1.5 × 106	3.5	3	1	2	12
100 mm	4 × 106	8	8	3	6	34

Resultados

Figura 1: Producción del virus concentrado y estimación del título. (A) Intensidad de fluorescencia de GFP (proteína verde fluorescente) tras infectar células HEK-293T con lentivirus no concentrado (1x) y lentivirus concentrado (100x). (B) Comparación de las tasas de infección del lentivirus no concentrado (1x) y del lentivirus concentrado (100x), detectadas mediante citometría de flujo. (C) Estimación del título del lentivirus concentrado. Barras de escala = 250 µm. Abreviaturas: GFP = proteína verde fluorescente; TU = unidades transducentes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.45 μM filtro	Millipore	SLHVR33RB
etanol al 95%/100%	LANBAO	210106	Almacenado a temperatura ambiente
Antibióticos (Pen/Estrep)	Gibco	15140-122	Almacenado a -20 °C
Anticuerpo anti-TRP2/DCT	Abcam	ab74073	Huésped/Isotipo: IgG de conejo Reactividad de especie: Ratón/Humano Dilución de 1:200 para usar
DMEM (alta glucosa)	HyClone	SH30243.01	Almacenado a 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Almacenado a temperatura ambiente
SFB	Gibco	10270-106	Almacenado a -20 °C Calentar inactivado antes del uso
Gelatina	Sigma	G9391	Almacenado a temperatura ambiente
Plásmidos GFP-PURO (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 y Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Almacenado a -20 °C
Hematoxilina	Abcam	ab220365	Almacenado a temperatura ambiente
Lipofectamina 2000	Invitrogen	11668-019	Reactivo de transfección, almacenado a 4 °C
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Almacenado a temperatura ambiente
Forbol 12-miristato 13-acetato (TPA)	Sigma	P8139	Concentración del stock 1 mM Concentración final 200 nM
Polibreno	Sigma	H9268	reactivo catiónico de transfección polimérico; concentración stock 8 μg/µLFinal concentración 4 ng/µL
Puromicina	Gibco	A11138-03	Almacenado a -20 °C
Factor de crecimiento fibroblástico humano recombinante	Invitrogen	13256-029	Concentración stock 4 μg/mLFiconcentración final 10 ng/mL
Insulina humana recombinante	Sigma	I3536	Concentración stock 10 mg/mL Concentración final 5 µg/mL