Producción de partículas similares a virus competentes para la transcripción y replicación del virus del Ébola que contienen un gen reportero

Resumen

Fuente: Hoenen, T., et al. Modelado del ciclo vital del virus del Ébola en condiciones de nivel de bioseguridad 2 con partículas tipo virus que contienen minigenomas tetracistónicos. J. Vis. Exp. (2014)

Este video demuestra cómo se transfecta un plásmido de minigenoma tetracistónico que imita el genoma del virus de Ébola en células humanas junto con plásmidos auxiliares. Dentro de las células, se expresan proteínas virales y luciferasa, lo que conduce al ensamblaje y brotamiento de partículas virales similares a virus, no patógenas y con capacidad de replicación.

Protocolo

1. Transfección de células productoras para la producción inicial de partículas tipo virus competentes para la transcripción y replicación o trVLPs

1. 24 hr después de dividir las células (véase Figura 1 para obtener una visión general del cronograma del experimento), pipetee ADN plasmídico (para las cantidades véase Tabla 1) en un criovial estéril de 2 mL utilizando puntas filtradas. Añada 100 µL de OptiMEM por pocillo al ADN. Vortexe brevemente la mezcla y centrifugue suavemente los tubos utilizando una microcentrífuga. Si se van a transfectar varios pocillos con plásmidos idénticos, puede prepararse una mezcla maestra para varios pocillos.
2. Vortexe brevemente el vial con Transit LT1 antes de usarlo. Añada 7,5 µL de Transit LT1 por pocillo al ADN diluido. Vortexe suavemente la mezcla, teniendo cuidado de no acumular líquido en la tapa del criovial, e incube durante 15 min a temperatura ambiente.
3. Mezcle suavemente el complejo de transfección pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Añada 100 µL de los complejos de transfección gota a gota a cada pocillo. Mueva la placa hacia adelante/atrás y de lado a lado para distribuir los complejos de transfección. No gire la placa, ya que esto provocaría una distribución desigual de los complejos de transfección.
4. Devuelva las células al incubador.
5. Después de 24 hr, retire el sobrenadante de las células. Añada 4 mL de DMEM (Medio de Eagle Modificado por Dulbecco) con 5 % de FBS (Suero de Feto Bovino), 2 mM de L-glutamina, 1x pen/strep (Penicilina/Estreptomicina) (DMEM5) a las células. Este paso puede realizarse con hasta 3 pocillos a la vez sin que se sequen los pocillos, siempre que contengan muestras idénticas (de lo contrario, debido a la naturaleza autorreplicativa de los trVLPs (Partículas Tipo Virus Competentes para la Transcripción y la Replicación) en este sistema, podría surgir un problema de contaminación cruzada, y este paso debería realizarse un pocillo a la vez).
6. Devuelva las células al incubador.

Tabla 1. Cantidades de ADN para la transfección. La cantidad de cada plásmido necesaria para la transfección de células productoras y células diana se muestra en ng por pocillo de una placa de 6 pocillos.

	Células productoras (p0)	Células diana (p1 y superiores)
pCAGGS-NP	125	125
pCAGGS-VP35	125	125
pCAGGS-VP30	75	75
pCAGGS-L	1,000	1,000
p4cis-vRNA-RLuc	250	-
pCAGGS-T7	250	-
pCAGGS-Tim1	-	250

Resultados

Figura 1. Cronograma de un ensayo de trVLP tetracistónico para 3 pasajes consecutivos. Se indican los días para la siembra de células (s), transfección de células (t), infección de células (i), cambio de medio (c) y recolección de células y trVLP (h) durante tres pasajes consecutivos (indicados por flechas).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matraz para cultivo celular de 75 cm²	Corning	430641
DMEM	Sigma	D6546	Calentar a 37°C antes de usar
FBS	Life technologies	26140-079	Inactivar por calor durante 30 min a 56°C
L-Glutamina	Life Technologies	25030-081	100x
Pen/strep	Life Technologies	15070-063	100x
Placas de 6 pocillos	Costar	3516
Opti-MEM I	Life Technologies	31985-070
Transit LT1	Mirus	MIR 2300